1,25-二羥基維生素D3對慢性結(jié)腸炎小鼠脾臟免疫功能的影響.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥，具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，免疫調(diào)控失衡引發(fā)的異常免疫反應(yīng)被認(rèn)為是UC發(fā)病機(jī)制中最重要的部分。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，異?？乖せ钚?yīng)T細(xì)胞及其亞群，介導(dǎo)T輔助(T helper，Th)1型、Th2型和Th17型免疫反應(yīng)，分泌大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ

2、)、白介素(interleukin，IL)-6和IL-17等，與炎性細(xì)胞及其他炎性介質(zhì)一起引發(fā)固有免疫應(yīng)答。此外，抗原提呈細(xì)胞，如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等可以將抗原呈遞至潘氏小結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)等次級淋巴器官，進(jìn)一步誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)生。
　　脾臟是最大的外周免疫器官，是機(jī)體發(fā)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。眾多研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病都存在脾臟免疫細(xì)胞的活化，炎性因子數(shù)量的增加，這也支持異常免疫反應(yīng)是這

3、類疾病的共同發(fā)病特點(diǎn)。
　　1,25-二羥基維生素D3(1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25(OH)2D3)是維生素D的活性代謝產(chǎn)物，不僅對骨骼的生長發(fā)育不可或缺，對細(xì)胞的生長分化、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能也有重要的調(diào)節(jié)作用。在1型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的動物模型中發(fā)現(xiàn)，1，25(OH)2D3及其類似物能預(yù)防或抑制這類疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此我們推測，1，25(OH)2D3可能通過免疫調(diào)節(jié)作用對結(jié)腸炎的發(fā)病起

4、到抑制和治療作用。
　　目的：探討1,25(OH)2D3對右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠脾臟免疫功能的影響。
　　方法：①30只雄性C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分入Control組、DSS組和DSS+VD組，每組10只。Control組持續(xù)飲用蒸餾水；DSS組和DSS+VD組間斷飲用2％DSS，時間段為分別為第1～5天、第8～12天、第15～19天、第

5、22～26天、第27和第28天，其余時間飲用蒸餾水。造模第14天起開始干預(yù)：DSS+VD組給予1，25(OH)2D3(0.2μg/25 g/天)灌胃，干預(yù)14天；Control組與DSS組給予等體積PBS灌胃干預(yù)14天，第29天處死動物。②每天觀察小鼠精神狀態(tài)、體重變化、活動情況、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食以及大便性狀等，評估疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)。③觀察脾臟形態(tài)學(xué)改變，記錄脾臟重量和長度，計(jì)算脾臟指

6、數(shù)變化。④應(yīng)用蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察脾臟組織病理學(xué)改變。⑤分離脾臟單個核細(xì)胞并計(jì)數(shù)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activated cellsorting，F(xiàn)ACS)檢測巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的比例，同時采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測脾臟單個核細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-6的水平。⑥

7、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Real-time fluorescent quantitation PCR(Real-time Q-PCR)技術(shù)檢測脾組織中IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-6的分布及其mRNA的水平。
　　結(jié)果：①與Control組相比，DSS組和DSS+VD組小鼠體重顯著下降(15.50％±1.50％vs0.00％±0.00％，P＜0.05)，經(jīng)1，25(OH)2D3干預(yù)后，DSS+VD組體重較DSS組顯著回升

8、(5.20％±0.53％vs19.60％±1.82％，P＜0.05)；與Control組相比，DSS組和DSS+VD組DAI評分逐漸升高，經(jīng)1，25(OH)2D3干預(yù)后，DSS+VD組DAI評分顯著降低(3.77±0.36vs1.79±0.19，P＜0.001)。②Control組脾臟大小均勻，顏色紅潤，表面光滑，切面脾小結(jié)清晰，脾臟重量為0.048 g±0.018 g，脾臟長度為1.15 cm±0.06cm。DSS組脾臟明顯腫脹，顏色

9、稍暗，切面脾小結(jié)不清晰，脾臟重量顯著增加(0.146 g±0.023 g vs0.048 g±0.018 g，P＜0.001)，脾臟長度也比Control組顯著增加(1.60 cm±0.14 cm vs1.15 cm±0.06 cm，P＜0.001)。DSS+VD組脾臟較DSS組體積減小，切面脾小結(jié)不清晰，脾臟重量與DSS組相比下降(0.093 g±0.016 g vs0.146 g±0.023 g，P＜0.005)，脾臟長度無顯著差異

10、(1.40 cm±0.18 cm vs1.60 cm±0.14 cm，P＞0.05)。進(jìn)一步計(jì)算脾臟指數(shù)，Control組為0.263±0.058，DSS組比Control組顯著增加(0.787±0.140 vs0.263±0.058，P＜0.001)，DSS+VD組脾臟指數(shù)比DSS組減小(0.425±0.052 vs0.787±0.140，P＜0.01)，與Control組相比無顯著差異(0.425±0.052 vs0.263±0.0

11、58，P＞0.05)。③組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Control組脾組織白髓結(jié)構(gòu)完整清晰，脾竇、脾索排列規(guī)整。DSS組脾組織與Control組相比，白髓面積增加，結(jié)構(gòu)稍紊亂，生發(fā)中心結(jié)構(gòu)不清，動脈周圍淋巴鞘細(xì)胞密度增大；紅髓充血，淋巴細(xì)胞浸潤，伴有多形巨細(xì)胞數(shù)量增加。DSS+VD組脾組織白髓結(jié)構(gòu)較規(guī)整，紅髓可見陳舊性出血，充血及淋巴細(xì)胞浸潤較DSS組減少。④Control組脾臟分離出的單個核細(xì)胞總數(shù)約為63.92×106個±7.18×106個

12、，F(xiàn)ACS檢測其中巨噬細(xì)胞比例為2.95％±0.89％，樹突細(xì)胞的比例為2.38％±0.85％。DSS組比Control組單個核細(xì)胞總數(shù)顯著增加(157.10×106個±17.32×106個vs63.92×106個±7.18×106個，P＜0.001)，巨噬細(xì)胞(7.65％±1.07％vs2.95％±0.89％，P＜0.001)和樹突細(xì)胞(6.45％±0.86％vs2.38％±0.85％，P＜0.001)的比例比Control組顯著升高

13、。DSS+VD組單個核細(xì)胞總數(shù)比DSS組減少(116.56×106個±10.63×106個vs157.10×106個±17.32×106個，P＜0.005)，巨噬細(xì)胞比例比DSS組下降(4.98％±0.88％vs7.65％±1.07％，P＜0.05)，樹突細(xì)胞比例顯著下降(2.68％±0.53％vs6.45％±0.86％，P＜0.001)，與Control組相比無顯著差異(2.68％±0.53％vs2.38％±0.85％，P＞0.05)

14、。ELISA檢測單個核細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-6的水平發(fā)現(xiàn)，DSS組未刺激的細(xì)胞分泌的上述炎癥因子的水平(IFN-γ：1.34 ng/mL±0.21 ng/mL vs0.26 ng/mL±0.05 ng/mL，P＜0.01；TNF-α：0.36 ng/mL±0.05ng/mL vs0.19 ng/mL±0.03 ng/mL，P＜0.01；IL-17:0.37 ng/mL±0.05 ng/mLvs0.22 ng/

15、mL±0.03 ng/mL，P＜0.01；IL-6:0.16 ng/mL±0.03 ng/mL vs0.08ng/mL±0.01 ng/mL，P＜0.01)和刺激的細(xì)胞分泌的炎癥因子水平(IFN-γ：8.56 ng/mL±0.92 ng/mL vs2.89 ng/mL±0.51 ng/mL，P＜0.01；TNF-α：2.87ng/mL±0.29 ng/mL vs0.37 ng/mL±0.04 ng/mL，P＜0.01；IL-17:3.6

16、6 ng/mL±0.49 ng/mL vs0.41 ng/mL±0.06 ng/mL，P＜0.01；IL-6:2.17 ng/mL±0.33ng/mL vs0.29 ng/mL±0.04 ng/mL，P＜0.01)均比Control組顯著升高。經(jīng)1，25(OH)2D3干預(yù)后，DSS+VD組未刺激的細(xì)胞分泌的上述炎癥因子的水平(IFN-γ：0.97 ng/mL±0.16 ng/mL vs1.34 ng/mL±0.21 ng/mL，P＜0.

17、01；TNF-α：0.26 ng/mL±0.02 ng/mL vs0.36 ng/mL±0.05 ng/mL，P＜0.01；IL-17：0.29 ng/mL±0.05 ng/mL vs0.37 ng/mL±0.05 ng/mL，P＜0.01；IL-6:0.12ng/mL±0.03 ng/mL vs0.16 ng/mL±0.03 ng/mL，P＜0.01)和刺激的細(xì)胞分泌的炎癥因子水平(IFN-γ：6.83 ng/mL±0.53 ng/m

18、L vs8.56 ng/mL±0.92ng/mL，P＜0.01；TNF-α：0.73 ng/mL±0.06 ng/mL vs2.87 ng/mL±0.29ng/mL，P＜0.01；IL-17:1.91 ng/mL±0.23 ng/mL vs3.66 ng/mL±0.49 ng/mL，P＜0.01；IL-6:1.23 ng/mL±0.26 ng/mL vs2.17 ng/mL±0.33 ng/mL，P＜0.01)均顯著下降。⑤免疫組織化學(xué)

19、染色可見炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-6在Control組脾組織僅有少量表達(dá)，DSS組上述4種因子的表達(dá)量顯著升高(0.39±0.04 vs0.14±0.02，P＜0.001；0.48±0.05 vs0.10±0.01，P＜0.001；0.59±0.06 vs0.27±0.02，P＜0.001；0.63±0.06 vs0.25±0.02，P＜0.001)，DSS+VD組脾組織的表達(dá)量比DSS組降低(0.17±0.02

20、 vs0.39±0.04，P＜0.001；0.23±0.02 vs0.48±0.05，P＜0.001；0.31±0.05 vs0.59±0.06，P＜0.001；0.32±0.03 vs0.63±0.06，P＜0.001)。⑥Real-time Q-PCR檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，DSS組脾組織IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA、IL-17 mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高(13.36±1.25 vs

21、1.00±0.00，P＜0.001；6.21±0.69 vs1.00±0.00，P＜0.001；5.87±0.61 vs1.00±0.00，P＜0.001；8.12±0.64 vs1.00±0.00，P＜0.001)，DSS+VD組IFN-γ mRNA、TNF-α mRNA、IL-17 mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)水平比DSS組降低(7.97±0.73 vs13.36±1.25，P＜0.001；4.72±0.61 vs6.21±0.

22、69，P＜0.05；3.02±0.47vs5.87±0.61，P＜0.001；4.21±0.52 vs8.12±0.64，P＜0.001)。⑦檢測各組血鈣水平發(fā)現(xiàn)，DSS組比Control組略降低(2.33±0.06 mmol/L vs2.50±0.03mmol/L，P＞0.05)，DSS+VD組略升高(3.33±0.32 mmol/L vs2.33±0.06mmol/L，P＞0.05)，但三組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：1