可顯著提高下肢缺血性疾病干細(xì)胞移植效率的新型細(xì)胞移植體系研究.pdf

1、下肢缺血性疾病是老年人的常見疾病，也是世界上致殘率最高的疾病之一。目前的治療方法主要包括傳統(tǒng)的藥物治療和動脈旁路術(shù)，療效仍不理想。近幾年，干細(xì)胞移植作為一個新興的治療手段開始應(yīng)用于下肢缺血性疾病的治療。它使用可分化，可自我更新的干細(xì)胞來代替死亡的肌肉細(xì)胞。干細(xì)胞治療的療效直接取決于注射后滯留在肌肉中的細(xì)胞的數(shù)量和存活率。但國內(nèi)外研究表明移植干細(xì)胞在肌肉中的滯留率和存活率極低，造成干細(xì)胞治療依然集中在動物實驗和臨床試驗階段，難以在臨床上應(yīng)

2、用。所以提高移植干細(xì)胞滯留率和生存率是目前干細(xì)胞移植治療領(lǐng)域亟需解決的科學(xué)問題。移植干細(xì)胞的載體是影響干細(xì)胞滯留率的一個主要因素，目前國內(nèi)外尚無理想的應(yīng)用于干細(xì)胞移植的專用載體，因此亟需創(chuàng)建一種新型高效的細(xì)胞載體。移植干細(xì)胞的生存率低是影響干細(xì)胞移植臨床應(yīng)用的又一個主要因素。缺血肢體處于一個低氧、低營養(yǎng)的狀態(tài)，移植細(xì)胞極易死亡，故而造成移植細(xì)胞的大量喪失，因此要真正實現(xiàn)下肢缺血性疾病干細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用，就需要創(chuàng)造出可大幅提高干細(xì)胞存活

3、率的微環(huán)境，但目前國內(nèi)外仍無有效解決該問題的文獻(xiàn)報道。
　　目的：擬制備出溫敏、pH敏感且機(jī)械性能適宜的水凝膠作為干細(xì)胞移植的載體，提高移植干細(xì)胞的滯留率，將氧氣釋放微球引入該載體，以期達(dá)到提高移植干細(xì)胞及周圍的肌肉細(xì)胞在缺血、缺氧環(huán)境下的存活率，從而促進(jìn)肌細(xì)胞再生，且盡量多的保留原有的肌細(xì)胞，并觀察這種新型的干細(xì)胞移植體系的治療效果；利用本課題組制備的新型水凝膠作為干細(xì)胞移植的載體，提高移植干細(xì)胞的滯留率，將 bFGF引入該載體

4、，以期促進(jìn)一部分移植干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)缺血肢體盡早到達(dá)血運(yùn)重建，改善肢體缺血狀態(tài)，提高肌肉功能，并觀察該體系對小鼠下肢缺血的治療效果。探討新的移植體系可干預(yù)的影響移植干細(xì)胞功能的其他靶點，為進(jìn)一步改善干細(xì)胞移植體系提供思路。
　　方法：制備出水凝膠，建立新型細(xì)胞移植體系，并利用 dsDNA濃度測定、活細(xì)胞熒光成像、免疫熒光染色、實時聚合酶鏈反應(yīng)等方法體外驗證該體系對干細(xì)胞生存及分化的影響；建立小鼠下肢缺血模型，利用

5、活細(xì)胞熒光成像、免疫熒光染色、實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白印跡法、蘇木精-伊紅染色、梅森三色染色、多普勒血流檢測、跑步測試等方法體內(nèi)驗證該體系對干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的存活分化的影響，以及該體系對小鼠缺血下肢血運(yùn)重建及恢復(fù)肌肉功能的效果。用成管實驗、細(xì)胞粘附實驗、細(xì)胞遷移實驗、蛋白印跡法探討肢體缺血狀態(tài)影響干細(xì)胞功能的機(jī)制。
　　結(jié)果：引入氧氣釋放微球的干細(xì)胞移植體系，體外檢測， dsDNA濃度測定隨時間增加而增高，且明顯高于陰性對照組（P

6、<0.05），與活細(xì)胞熒光成像結(jié)果一致，證實新的移植體系能大大提高干細(xì)胞的生存率；免疫熒光染色、實時聚合酶鏈反應(yīng)也證實 ORM組干細(xì)胞向肌肉細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化更多；在小鼠下肢缺血模型中，活細(xì)胞熒光成像也證實此移植體系能大大提高干細(xì)胞的生存率；免疫熒光染色證實ORM組干細(xì)胞向肌肉細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化更多；蘇木精-伊紅染色、梅森三色染色、多普勒血流檢測、跑步測試等方法證實此體系有效的改善了缺血肢體肌肉萎縮情況，有助于肌肉功能的

7、恢復(fù)。引入bFGF的干細(xì)胞移植體系，體外檢測，dsDNA濃度測定隨時間增加而增高，且明顯高于陰性對照組（P<0.05），與活細(xì)胞熒光成像結(jié)果一致，證實此移植體系也能提高干細(xì)胞的生存率；免疫熒光染色、實時聚合酶鏈反應(yīng)也證實bFGF組干細(xì)胞向肌肉細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化更多；在小鼠下肢缺血模型中，活細(xì)胞熒光成像也證實此移植體系能大大提高干細(xì)胞的生存率；免疫熒光染色、蛋白印跡法證實bFGF組干細(xì)胞向肌肉細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化更多；蘇木精

8、-伊紅染色、梅森三色染色、多普勒血流檢測也證實此體系有效的促進(jìn)缺血肢體盡快血運(yùn)重建，極大改善肌肉萎縮情況。成管實驗、細(xì)胞粘附實驗、細(xì)胞遷移實驗證實PA對EPCs功能有明顯抑制作用；蛋白印跡法證實PA誘導(dǎo)的神經(jīng)酰胺對EPCs的抑制作用是通過Akt/eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：新建立的干細(xì)胞移植體系能大大提高干細(xì)胞的滯留率和生存率，并能有效的分化成所需細(xì)胞系，改進(jìn)干細(xì)胞治療下肢缺血性疾病的效果。進(jìn)一步的機(jī)制探討為改進(jìn)此新型