胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血性疾病中的治療及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、體外擴(kuò)增培養(yǎng)和分化
　　目的：研究胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞提取方法、體外擴(kuò)增培養(yǎng)和分化能力
　　方法：采用酶學(xué)組織消化法從足月產(chǎn)胎兒胎盤中分離、然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增出胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在整個(gè)原代細(xì)胞和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，在顯微鏡下記錄觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖情況及形態(tài)特征變化情況。流式細(xì)胞檢測(cè)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD28，CD34，CD45，CD49b，CD73，CD90，CD105，HLA-DR

2、等。比較胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)特異誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂、成骨和新生血管誘導(dǎo)分化，并對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定。檢測(cè)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞活力以及生長(zhǎng)曲線檢測(cè)。
　　結(jié)果：原代細(xì)胞在培養(yǎng)到第三代時(shí)候，細(xì)胞呈形態(tài)均一的紡錘形，排列緊密，呈規(guī)則漩渦狀貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞表型鑒定結(jié)果顯示：細(xì)胞表達(dá)CD10，CD29，CD44，CD49b，CD73；不表達(dá)CD34，CD45，HLA-DR。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞

3、在特異的誘導(dǎo)下能向骨、脂肪和內(nèi)皮細(xì)胞分化。通過(guò)分段降溫凍存復(fù)蘇后，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性仍保持穩(wěn)定，基本形態(tài)符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，仍具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)酶消化法成功的從胎盤中獲取了間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)方法高效的擴(kuò)增了目的細(xì)胞。獲取的細(xì)胞形態(tài)、功能穩(wěn)定。并成功的向骨、脂肪、內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化。分段降溫法保存胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞后，細(xì)胞復(fù)蘇后的形態(tài)、功能、生長(zhǎng)能力和分化能力沒(méi)

4、有受到明顯影響。
　　第二部分胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)下肢缺血性疾病的治療效果和機(jī)制研究
　　目的：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)下肢缺血性疾病的治療效果和機(jī)制研究
　　方法：模擬缺血缺氧環(huán)境，在體外低氧環(huán)境下培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，評(píng)價(jià)其分化，和旁分泌細(xì)胞因子情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，采用CM-DIL標(biāo)記胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，建立小鼠下肢缺血模型后，缺血區(qū)域局部注射移植胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。經(jīng)免疫組化、激光多普勒血流儀、下肢功能性檢測(cè)、炎癥因子、炎癥細(xì)胞

5、浸潤(rùn)、抗凋亡蛋白、細(xì)胞因子和毛細(xì)血管密度測(cè)量，評(píng)價(jià)胎盤干細(xì)胞移植治療的療效。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)證實(shí)低氧條件下，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌促進(jìn)血管生成的活性細(xì)胞因子明顯增高，主要的細(xì)胞因子有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)未發(fā)現(xiàn)明顯變化；移植的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞注射移植到小鼠缺血下肢肌肉組織中，從下肢肌力、下肢血流、

6、下肢運(yùn)動(dòng)能力、下肢激光多普勒?qǐng)D譜等方面的比較，均證實(shí)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)下肢缺血有保護(hù)作用。HE染色、免疫組化檢測(cè)的結(jié)果顯示，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)缺血區(qū)域血管的新生。對(duì)缺血組織中凋亡細(xì)胞、炎癥因子浸潤(rùn)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞能減少凋亡發(fā)生，降低炎癥因子的浸潤(rùn)。Western-blot蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞能明顯增加缺血組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)論：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧環(huán)境中旁分泌促進(jìn)血管生成的活性細(xì)

7、胞因子：VEGF，bFGF和IGF-1明顯增加。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性下肢血管病變有效，其作用機(jī)制可能與其血管內(nèi)皮細(xì)胞分化能力和自分泌/旁分泌促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子有關(guān)，同時(shí)也能降低凋亡，降低炎癥因子浸潤(rùn)。
　　第三部分胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心臟缺血性疾病的治療效果和機(jī)制研究
　　目的：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心臟缺血性疾病的治療效果和機(jī)制研究
　　方法：建立小鼠心臟缺血模型后，在心臟局部缺血區(qū)域注射移植用生物膠包被的胎盤干

8、細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未治療心肌梗死組和單純生物膠治療組。心梗7天后經(jīng)心臟B超檢測(cè)心臟功能、用Pressure Volume系統(tǒng)對(duì)心臟實(shí)時(shí)壓力容積以及心率適應(yīng)性功能性檢測(cè)、用Fluo-4AM對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子超載檢測(cè)、TTC法進(jìn)行心肌梗死面積檢測(cè)和Western-blot蛋白印記法檢測(cè)鈣離子相關(guān)蛋白表達(dá)水平，來(lái)評(píng)價(jià)胎盤干細(xì)胞移植治療的療效和具體機(jī)制。
　　結(jié)果：注射移植的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞整合入小鼠缺血梗死區(qū)心肌組織，降低心肌梗死面積，提高心