HIV派生的新型microRNA99對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討HIV派生的新型microRNA99對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　?。?）構(gòu)建巨噬細(xì)胞模型
　　用PMA（佛波酯）刺激THP-1（人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞）分化成巨噬細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化。
　?。?）HIV派生的新型microRNA99對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的影響
　　以化學(xué)合成的物質(zhì)作用于巨噬細(xì)胞，分組如下：
　?、賹?shí)驗(yàn)組1：

2、巨噬細(xì)胞+轉(zhuǎn)染試劑+microRNA99
　　②對(duì)照組1：巨噬細(xì)胞+轉(zhuǎn)染試劑+microRNA-TRA
　?、蹖?duì)照組2：巨噬細(xì)胞+LipidA
　?、軐?duì)照組3：巨噬細(xì)胞+培養(yǎng)基
　　37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)收集并檢測(cè)上清液中TNF-α釋放的情況。
　?。?）HIV派生的新型microRNA99對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的機(jī)制研究
　?、LR8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分組如下：
　?、賹?shí)驗(yàn)組

3、a：巨噬細(xì)胞+核轉(zhuǎn)液+TLR8質(zhì)粒
　?、趯?duì)照組b：巨噬細(xì)胞+核轉(zhuǎn)液+空質(zhì)粒
　　37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后查看細(xì)胞內(nèi)熒光并收集細(xì)胞。
　　ⅱ將microRNA99和LipidA分別作用于沉默后的巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組如下：
　?、賹?shí)驗(yàn)組a：巨噬細(xì)胞-TLR8質(zhì)粒+microRNA99+轉(zhuǎn)染試劑
　?、趯?duì)照組a：巨噬細(xì)胞-空質(zhì)粒+microRNA99+轉(zhuǎn)染試劑
　?、蹖?shí)驗(yàn)組b：巨噬細(xì)胞-TL

4、R8質(zhì)粒+LipidA
　?、軐?duì)照組b：巨噬細(xì)胞-空質(zhì)粒+LipidA
　　37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后收集上清液。
　　（4）測(cè)量方法：
　?、僭诘怪蔑@微鏡下觀察THP-1細(xì)胞是否轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞；
　?、谠跓晒夤簿劢瓜虏榭醇?xì)胞內(nèi)熒光判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況；
　?、鄄捎肳estern Blot方法測(cè)兩組TLR8蛋白的表達(dá)水平；
　?、苡肊LISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平。

5、
　　結(jié)果:
　　（1）THP-1向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)觀察
　　THP-1由圓形或類(lèi)圓形，單個(gè)或葡萄串樣聚集的懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)化為梭形或多邊形的貼壁細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞。
　　（2）HIV派生的新型microRNA99對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的影響
　　在microRNA99實(shí)驗(yàn)組和LipidA對(duì)照組，上清液中TNF-α的含量明顯高于microRNA-TAR對(duì)照組和空白對(duì)照組（p<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；micro

6、RNA-TAR對(duì)照組和空白對(duì)照組無(wú)明顯差異（p>0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；microRNA99實(shí)驗(yàn)組較LipidA對(duì)照組，上清液TNF-α水平明顯升高（p<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）HIV派生的新型microRNA99對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的機(jī)制研究
　　ⅰ在熒光共聚焦下查看細(xì)胞熒內(nèi)光判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況
　　巨噬細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明TLR8質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)。
　?、⒉捎肳estern

7、 Blot方法測(cè)兩組TLR8蛋白的表達(dá)水平
　　轉(zhuǎn)染TLR8質(zhì)粒細(xì)胞中TLR8蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（p<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　ⅲ用ELISA試劑盒測(cè)定上清液TNF-α的水平
　　在microRNA99實(shí)驗(yàn)組，上清液中TNF-α的含量明顯低于microRNA99對(duì)照組
　?。╬<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LipidA實(shí)驗(yàn)組與LipidA對(duì)照組無(wú)明顯差異（p>0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論: