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文檔簡介
1、肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種成人起病的、進行性、致死性神經系統(tǒng)變性疾病,病變累及皮層、腦干及脊髓前角運動神經元,導致全身肌肉的進行性萎縮、無力?;颊叨嘤诎l(fā)病后的3~5年內因呼吸肌萎縮無力而死亡。由于其發(fā)病機制的復雜性,目前尚無有效的治療方法。ALS的患病率約為5~7/10萬,其中約90%為散發(fā)型肌萎縮側索硬化(SALS),其余10%為家族性肌萎縮側索硬化(FALS),約20%
2、的FALS是由銅/鋅超氧化物歧化酶1基因(SOD1)的突變引起。SOD1-G93A轉基因小鼠為SOD1基因93號位點發(fā)生甘氨酸→精氨酸的突變,高度模擬人類ALS疾病的病理及臨床特點,被廣泛地應用于ALS病理機制的研究。
ALS的病理機制目前尚未完全明確,已知的有蛋白錯誤折疊、興奮性氨基酸毒性、線粒體損傷、氧化應激等,近年來,一些新的證據(jù)表明D-絲氨酸(D-serin,D-Ser)—種內源性的N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA
3、R)的協(xié)同激動劑,在ALS病人中有所升高,并可加劇運動神經元的死亡。而造成D-Ser升高的主要原因在于D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase DAO)的活性降低。
DAO是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的典型黃素蛋白酶類,可氧化D-氨基酸如D-丙氨酸、D-絲氨酸、D-脯氨酸的氨基生成相應的酮酸。DAO廣泛存在于哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)(CNS)、肝臟及腎臟,在CNS主要存在于腦干和脊髓。在哺乳動物和
4、低等生物如酵母、真菌和細菌的DAO蛋白之中,Arg199殘基緊靠FAD結合位點,處于Tyr228和His307殘基之間,對酶活性起著至關重要的作用。發(fā)生于此位點的突變(R199W)會在細胞中引起不良后果,可導致ALS的發(fā)生發(fā)展。研究認為,脊髓內存在的高水平的DAO主要作用在于降解D-Ser,從而通過NMDAR介導的神經毒性調控神經元的存活。而不論在fALS患者中還是在SOD1-G93A模型小鼠中,腰髓DAO水平均有所降低。我們設想補充A
5、LS小鼠模型腰髓中的DAO水平可能會增加D-Ser的降解,從而減輕NMDAR過度激活造成的神經毒性,保護運動神經元。
自1952年DNA被發(fā)現(xiàn)作為遺傳物質以來,利用載體(如病毒)攜帶DNA以治療遺傳性疾病的方法便應運而生。常用于轉導中樞神經系統(tǒng)的載體有包含質粒的納米顆粒、逆轉錄病毒重組載體、腺相關病毒(AAV)、腺病毒和單純皰疹病毒(HSV)。其中AAV已成為最安全、最常用的一種用于傳遞治療基因的病毒載體。
本研究應
6、用CMV啟動子調控下的單鏈腺相關病毒血清9型(ssAAV9),攜帶編碼的小鼠DAO基因(ssAAV9-DAO)經鞘內注射的途徑干預發(fā)病早期的SOD1-G93A轉基因小鼠,觀察上調小鼠腰髓內的DAO的水平對其行為學及病理表現(xiàn)的影響,并進一步探索其可能的機制。我們查閱文獻尚未見類似報道。
第一部分:ALS小鼠模型中DAO的表達及分布
目的:
我們對不同時期(60天齡—癥狀前期、90天齡—癥狀早期、120~140
7、天齡—終末期)的SOD1-G93A轉基因小鼠腰髓組織內的DAO水平進行檢測,觀察DAO水平隨病程進展發(fā)生的變化,并進一步觀察DAO所在的細胞類型,為病毒載體系統(tǒng)的選擇提供依據(jù)。
方法:
我們選取由美國Jackson實驗室提供的SOD1-G93A轉基因小鼠作為動物模型,并應用其提供的引物序列和鑒定方法進行DNA鑒定,鑒定陽性的60天、90天及終末期小鼠作為研究對象,并以相同天齡的陰性小鼠作為陰性對照(即60天陽性、60
8、天陰性、90天陽性、90天陰性、終末陽性、終末陰性共6組),每組4只小鼠。小鼠新鮮取材后采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測小鼠腰髓DAO的表達水平。另取90d陽性小鼠3只,灌注取材后行25μm震蕩切片,采用免疫熒光共聚焦技術(confocal)觀察DAO主要存在的細胞類型。
結果:
1.與陰性鼠比較,SOD1-G93A小鼠腰髓 DAO蛋白水平在終末期顯著減少(P<0.05),其他時期則無顯著變化。
9、r> 2.免疫熒光共聚焦染色結果顯示SOD1-G93A小鼠腰髓DAO主要表達在運動神經元,此外星形膠質細胞和小膠質細胞也有極少量的表達。
結論:
SOD1-G93A小鼠腰髓組織內的DAO表達在終末期時顯著減少,說明了補充腰髓 DAO可能對 SOD1-G93A小鼠具有保護作用;SOD1-G93A小鼠腰髓中 DAO主要存在于運動神經元,這對選取神經元靶向的載體系統(tǒng)提供了依據(jù)。
第二部分:鞘內注射ssAAV9在
10、SOD1-G93A轉基因小鼠脊髓轉導效率的研究
目的:
通過給 SOD1-G93A轉基因小鼠鞘內注射 ssAAV9-GFP和ssAAV9-DAO,觀察在此種方法下,綠色熒光蛋白(GFP)在SOD1-G93A小鼠脊髓內的分布情況及轉導效率,以及小鼠腰髓組織DAO及D-Ser表達的變化,以確定此種方法的可行性。
方法:
選取SOD1-G93A轉基因小鼠作為研究對象,單次鞘內注射ssAAV9-GFP(1
11、×1012vg/kg)或ssAAV9-DAO(1×1012vg/kg),給藥3周后部分小鼠以4%的多聚甲醛液灌注固定,行脊髓組織25μm震蕩切片,部分小鼠新鮮取材,分離腰髓組織。通過免疫熒光共聚焦技術觀察 GFP表達及分布情況,蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測小鼠腰髓DAO的表達水平,免疫組織化學染色法觀察小鼠腰髓D-Ser的表達。
結果:
1.脊髓切片免疫熒光染色顯示腰髓可見較多GFP表達,另外骶髓、
12、胸髓也有少許GFP表達,頸髓則很少見。
2.免疫熒光共聚焦染色顯示GFP與神經元共定位,而不表達于星形膠質細胞和小膠質細胞,且SOD1-G93A轉基因小鼠腰髓運動神經元轉導效率約為12%。
3.Western blotting結果顯示ssAAV9-DAO組小鼠腰髓組織DAO表達明顯增多,同時免疫組織化學染色結果顯示,與 ssAAV9-GFP組小鼠相比,ssAAV9-DAO組小鼠腰髓組織D-Ser陽性細胞數(shù)顯著減少。<
13、br> 結論:
GFP主要表達于注射點附近的脊髓部位,腰髓為主;GFP主要表達于神經元,且腰髓運動神經元轉導效率約為12%;ssAAV9-DAO單次鞘內注射可增加SOD1-G93A小鼠腰髓內的DAO表達,同時降低D-Ser水平。說明了此種給藥方式可補充小鼠腰髓內的DAO水平并具有酶活性。
第三部分:鞘內注射ssAAV9-DAO對SOD1-G93A轉基因小鼠行為學影響及機制研究
目的:
通過給SO
14、D1-G93A轉基因小鼠鞘內注射ssAAV9-DAO,觀察過表達DAO對SOD1-G93A小鼠生存期、體重、轉輪試驗及組織病理改變的影響,并探索相關的保護機制。
方法:
選取由美國Jackson實驗室提供的SOD1-G93A轉基因小鼠作為ALS動物模型,并應用其提供的引物序列和鑒定方法進行DNA鑒定,選擇同窩配對的陽性鼠作為受試對象。小鼠90天齡時,選取體重接近(組間平均起始體重差別≤0.3g)的同窩小鼠,雌、雄各1
15、5對,隨機分配到治療組和對照組,分別給予ssAAV9-DAO和ssAAV9-GFP鞘內注射,觀察小鼠體重、轉輪變化及生存期。另外選取給予同樣干預方法的小鼠進行機制研究,給藥3周后取材,其中3對用0.05%的戊二醛-多聚甲醛液灌注固定,腰髓25μm震蕩切片,通過免疫組織化學染色法觀察SMI-32、Iba-1、GFAP的改變;L5前根切片甲苯胺藍染色觀察軸索破壞情況;余4對新鮮取材,腓腸肌冰凍切片HE染色觀察肌纖維情況;通過蛋白免疫印跡法檢
16、測腰髓TNF-α、IKBα、IKKβ、IKKγ、p-P65、p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9、Cd11b、GFAP的水平。
結果:
1.與ssAAV9-GFP組小鼠相比,ssAAV9-DAO組小鼠生存期延長6天,差異有統(tǒng)計學意義(n=30,P<0.05),其中,雌鼠延長8天,差異顯著(n=15,P<0.05),雄鼠也延長8天,但差異無統(tǒng)計學意義(n=15,P>0.05)。雄鼠兩組間的
17、體重、轉輪均無顯著差異;雌鼠 ssAAV9-DAO組僅在110天齡時短暫改善轉輪表現(xiàn)(P<0.05),體重則無顯著差異。
2.免疫組織化學染色結果顯示,與ssAAV9-GFP組小鼠相比,ssAA V9-DAO組小鼠腰髓組織 SMI32表達增多、GFAP、Iba-1表達減少,同時Western blotting結果顯示,ssAAV9-DAO組小鼠腰髓組織Cd11b、GFAP表達較對照組減少。即治療組腰髓運動神經元保留較對照組明顯
18、增多,而星形膠質細胞、小膠質細胞增生較對照組明顯減少。
3.L5前根切片甲苯胺藍染色結果顯示,與對照組小鼠相比,給藥組小鼠L5前根保留的軸索數(shù)量明顯增多。腓腸肌冰凍切片HE染色結果顯示,對照組小鼠肌纖維大小不一,可見大量中央核,給藥組較之有所改善。
4.腰髓組織Western blotting結果顯示,與ssAAV9-GFP組相比,ssAAV9-DAO組的NF-κB信號通路正向調節(jié)因子IKKβ、IKKγ水平顯著降低,
19、而負向調節(jié)因子IKBα顯著增高,另外反映NF-κB信號通路激活狀態(tài)的p-P65、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。同時,ssAAV9-DAO組促凋亡因子Bax、Caspase3、Caspase9均顯著降低,而抗凋亡因子Bcl-2顯著增高,且伴有p-Akt表達的增高(P<0.05)。
結論:
ssAAV9-DAO單次鞘內注射可延長癥狀期SOD1-G93A小鼠的生存期,但存在性別差異,造成此種差異的原因尚不完全明
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