鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及機制的研究.pdf

1、本文對鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：人臍帶Wharton’s jelly來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　目的：從臍帶Wharton’s jelly中分離、培養(yǎng)得到性狀穩(wěn)定的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)鑒定所獲取的傳代細(xì)胞，CCK-8法和流式細(xì)胞技術(shù)共同測定細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期，用于后續(xù)試驗。
　　方法：從協(xié)和醫(yī)院收集健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)

2、術(shù)后新生兒的臍帶，通過組織塊培養(yǎng)法從臍帶Wharton’s jelly中分離得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，酶消化法傳代。CCK-8法和流式細(xì)胞技術(shù)共同測定第三代細(xì)胞（P3）的增殖能力和細(xì)胞周期，取對數(shù)期生長的P3代培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表型CD73, CD90, CD105的表達和一些造血細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白 CD45, CD34, CD11b, CD19和人類白細(xì)胞抗原II（HLA-DR）的表達情況。
　　結(jié)果：用組

3、織塊培養(yǎng)法從臍帶Wharton’s jelly中分離得到的P3代培養(yǎng)細(xì)胞高表達間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表型CD73(94.45±2.14％), CD90(95.58±1.78%)和 CD105(95.62±1.62%)，而低表達或者不表達造血細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白CD34(0.49±0.19%), CD45(1.87±0.68%), CD19(0.33±0.11%), CD11b(0.10±0.03%)和HLA-DR(0.18±0.07%)，據(jù)此認(rèn)

4、為臍帶分離得到的貼壁細(xì)胞屬于間充質(zhì)干細(xì)胞；CCK-8檢測細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)細(xì)胞前24h內(nèi)增殖不明顯，2到3天后進入對數(shù)增長期并持續(xù)到第5到6天，然后到達生長平臺期；流式技術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)處于G0/G1細(xì)胞為75.1%、S期細(xì)胞為16.3%、G2/M細(xì)胞為8.6%，表明24.9%的細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，增殖能力比較旺盛。
　　結(jié)論：本實驗成功的通過組織塊培養(yǎng)法從臍帶中分離培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞具有性狀穩(wěn)定，增殖速度快的特點。

5、>　　第二部分：鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的治療作用。
　　目的：采用L5脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL)的方法建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛動物模型，經(jīng)鞘內(nèi)注射臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，HUC-MSCs），檢測其在大鼠脊髓能存活、分布情況以及對大鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀的改善作用。
　　方

6、法：SPF級雄性SD大鼠40只隨機分成4組，每組10只：(1)對照組（Sham組）:僅暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)，不結(jié)扎；鞘內(nèi)置管；動物疼痛模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（2）空白組（SNL組）：結(jié)扎左側(cè)L5脊神經(jīng)；鞘內(nèi)置管；動物疼痛模型成功后鞘內(nèi)不給予注射；（3）模型組（SNL+PBS組）：結(jié)扎左側(cè)L5脊神經(jīng)；鞘內(nèi)置管；動物疼痛模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（4）治療組（SNL+HUC-MSC組

7、）：結(jié)扎L5脊神經(jīng)，動物模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞1x106個（重懸在20ul無菌PBS中）。于大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎模型后的第1,2,3,5,7,9,11,14天檢測各組大鼠同側(cè)的熱刺激縮足反射潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL)和機械刺激撤足閾值（paw withdrawal mechanical threshold， PWMT)；治療組大鼠在造模后第7天隨機取3只處死取脊髓腰膨大

8、段檢測抗人細(xì)胞核抗體（anti-human nuclei monoclonal antibody），以追蹤移植的HUC-MSCs的存活和分布情況。
　　結(jié)果：行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，SNL組在造模后第一天出現(xiàn)了明顯的PWMT和 PWTL下降，并且第三天下降到最低并以此狀態(tài)持續(xù)到14天。造模后第三天鞘內(nèi)注射HUC-MSCs，PWMT從造模后第7天（注射后第4天）開始增加并持續(xù)到造模后14天；PWTL的趨勢和PWMT相似，增

9、加從造模后的第5天（注射后第2天）出現(xiàn)并且持續(xù)到造模后14天。免疫熒光發(fā)現(xiàn)在大鼠腰膨大段脊髓中檢測到抗人細(xì)胞核抗體的表達，主要分布在左側(cè)脊髓背角。
　　結(jié)論：本實驗通過L5-SNL成功建立了大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型；HUC-MSCs鞘內(nèi)注射后，能在脊髓內(nèi)存活和遷移到脊髓背角內(nèi)；鞘內(nèi)注射HUC-MSCs能夠明顯改善SNL大鼠的疼痛癥狀。
　　第三部分：鞘內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠神經(jīng)病理性疼痛治療作用的機制研究。
　　目的：

10、研究HUC-MSCs對SNL大鼠神疼痛癥狀治療作用的機制。
　　方法：SPF級雄性SD大鼠30只隨機分成3組，每組10只：(1)對照組（Sham組）:僅暴露左側(cè)L5脊神經(jīng)，不結(jié)扎；鞘內(nèi)置管；動物疼痛模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（2）模型組（SNL+PBS組）：結(jié)扎左側(cè)L5脊神經(jīng)；鞘內(nèi)置管；動物模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射注射無菌PBS20ul；（3）治療組（SNL+HUC-MSC組）結(jié)扎L5脊神經(jīng)，動物

11、模型成功后第三天蛛網(wǎng)膜下腔注射間充質(zhì)干細(xì)胞1x106個（重懸在20ul無菌PBS中）。各組大鼠在造模后14天處死取材檢測。EILSA方法檢測左側(cè)脊髓背角中的炎癥因子 IL-1β， IL-17A和 IL-10和血清中炎癥因子IL-1β，IL-17A的表達水平；Western blot檢測脊髓背角中BDNF蛋白的相對含量；免疫熒光和Western blot檢測左側(cè)脊髓背角里激活的的星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物IBA-1的

12、表達情況。
　　結(jié)果：與Sham組相比，ELISA結(jié)果表明SNL大鼠左側(cè)脊髓背角的促炎癥因子IL-1β和IL-17A明顯增加，抗炎因子IL-10并未發(fā)現(xiàn)明顯的改變；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)BDNF的蛋白合成增加；免疫熒光可以看到 SNL大鼠背角中的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活，表現(xiàn)為GFAP和IBA-1陽性標(biāo)志的細(xì)胞數(shù)量增多，Western blot檢測結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致， GFAP蛋白和 IBA-1蛋白量明顯增加

13、。鞘內(nèi)給予HUC-MSCs治療后，與SNL組相比，促炎因子IL-1β和IL-17A顯著減少，同時增加促炎因子IL-10的水平；免疫熒光觀測到左側(cè)脊髓背角的GFAP陽性的細(xì)胞和IBA-1陽性的細(xì)胞數(shù)量減少，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)GFAP蛋白和IBA-1蛋白量顯著減少。造模后第14天血清的IL-1β和 IL-17A在 Sham組、SNL組、SNL+HUC-MSC沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：HUC-MSCs對SNL大鼠疼痛起著