TNF-α預處理骨髓間充質干細胞抑制小膠質細胞活化治療神經(jīng)病理性疼痛的研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)發(fā)病機制復雜，傳統(tǒng)的抗炎藥、鈣離子通道拮抗劑、三環(huán)類抗抑郁藥等，在NPP的治療中非常局限，這使得NPP的治療成為臨床上亟待解決的問題。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)因其獨特的生物學特點和優(yōu)勢如：增殖率高、遺傳穩(wěn)定、低免疫原性、免疫調節(jié)作用等特點，而直接用于神經(jīng)病理性疼痛等疾病的治療。但BMMSCs發(fā)揮治療作用

2、的機制尚不明確。研究表明小膠質細胞(Microglia，MG)在微量促炎因子作用下即可活化，活化后的MG可釋放大量主導NPP發(fā)生與進展的炎性介質。因此，調節(jié)MG過度活化成為治療NPP的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可被移植微環(huán)境中的促炎因子激活，通過自身旁分泌功能抑制MG過度活化進而減輕NPP的發(fā)展。但目前促炎因子預處理BMMSCs作用于NPP的研究較少。因此，研究預處理BMMSCs在NPP的發(fā)病過程中的作用具有重要意義。
　　實驗目

3、的：
　　探討TNF-α預處理的BMMSCs對CCI大鼠鎮(zhèn)痛作用及可能機制
　　實驗內容：
　　1、培養(yǎng)并鑒定BMMSCs。
　　2、體外情況下TNF-α預處理BMMSCs對其抑制MG活化作用的影響
　　3、鞘內注射經(jīng)TNF-α預處理的BMMSCs對CCI大鼠MG活化及疼痛行為的影響
　　實驗方法：
　　1、采用貼壁分離法從雄性SD大鼠（3-4周齡）的股骨中分離BMMSCs。光鏡下觀察細胞形態(tài)、

4、流式細胞學技術檢測細胞表面標記物對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　2、選擇雄性SD大鼠（6-8周齡）120只，參照Bennett法制備CCI模型，隨機分為3組(n=40);①CCI組（A組）：造模后第7天鞘內注射不含BMMSCs的PBS20μl;②BMMSC移植組（B組）：造模后第七天鞘內注射含BMMSCs（1×106/只）的PBS20μl;③TNF-α預處理BMMSCs組（C組）：造模后第七天鞘內注射含TNF-α處理后的BMMSCs

5、（1×106/只）的PBS20μl。
　　3、觀察各組大鼠在手術前1天，術后第3、7、14、21、28天PWL、PWT。
　　4、分別于手術前一天，術后第3、7、14、21、28天采用頸椎脫臼法處死大鼠，分別取大鼠脊髓(SL)、腰段背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。采用ELISA技術檢測SL、DRG內TNF-α、IL-6、IL-10炎性因子水平;分別于術后14天取SL、DRG，采用免疫熒光技術檢測SL、DRG小膠質細胞表面標記物CD68

6、的表達水平。
　　5、為進一步驗證BMMSCs對小膠質細胞的影響，體外情況下采用LPS誘導MG活化，采用共培養(yǎng)的方法來檢測BMMSCs對LPS活化后的MG的作用。利用含1000ng/ml的TNF-α完全培養(yǎng)液對BMMSCs進行預處理;利用LPS（10μg/ml）誘導大鼠MG活化。MG分離純化后，以1×105/孔種植于6孔板中，按以下分組將MG和BMMSCs進行共培養(yǎng)24h。B組（單純BMMSCs組）、L+B組（LPS+BMMSCs

7、組）、T+B組（TNF-α預處理BMMSCs組）、L+T+B組（LPS+TNF-α預處理BMMSCs組）、M組（單純MG組）、L+M組（LPS+MG組）、B+L+M組(BMMSCs+LPS+MG組)、T+B+L+M組(TNF-α預處理BMMSCs+LPS+MG組)。
　　6、24h后，取培養(yǎng)液上清，采用ELISA技術檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子表達含量，免疫熒光法檢測MG表面標記物CD68抗體的表達水平。

8、
　　實驗結果：
　　1、采用貼壁分離法培養(yǎng)的BMMSCs，隨著細胞不斷傳代純化，細胞形態(tài)呈長梭狀且呈旋渦狀排列，細胞表型鑒定結果如下：CD29表達率99.59％，CD90表達率83.95％，呈陽性;CD34表達率0.1％，CD45表達率7％，呈陰性。
　　2、與CCI組、單純BMMSC組相比，TNF-α預處理BMMSCs組術前1天、術后28天PWT和PWL差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);在術后第3天PWT和PWL逐

9、漸降低，術后第7天降至最低，之后緩慢升高，于術后28天恢復至基線水平，在此期間TNF-α預處理BMMSCs術后7、14、21天PWT、PWL值均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。肉眼可見TNF-α預處理BMMSCs組大鼠精神狀態(tài)好，術側傷口恢復較快;與CCI組和單純BMMSC組相比，差異顯著。
　　3、BMMSCs移植后進行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)：TNF-α預處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經(jīng)節(jié)內TNF-α、IL-6等促炎

10、因子含量在術后第3、7天明顯升高，術后第14、21天促炎因子含量逐漸降低，術后28天促炎因子含量達到基線水平，與CCI組和單純BMMSC組相比，差異有明顯統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。然而，TNF-α預處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經(jīng)節(jié)內抑炎因子IL-10在術后第3、7表達呈低水平，在術后第14天逐漸上升，21天達到高峰，術后28天基本降至術前水平，與CCI組和單純BMMSC組相比，差異有明顯統(tǒng)計學意義(p＜0.05)
　　

11、4、與CCI組和單純BMMSC組相比，SL、DRG中小膠質細胞CD68表達水平明顯降低(p＜0.05)，而CD68在CCI組和單純BMMSC表達無明顯變化。
　　5、L+M組小膠質細胞的CD68表達增高，分泌TNF-α、IL-6含量明顯增多;B+L+M組以及T+B+L+M組的小膠質細胞CD68表達水平、TNF-α、IL-6分泌量低于L+M組，且B+L+M組與T+B+L+M組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　實驗結論：<