蛋白質(zhì)自噬性降解在ALS疾病中的作用及海藻糖對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因鼠的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分:海藻糖對(duì)過表達(dá)ALS相關(guān)毒性蛋白質(zhì)NSC-34細(xì)胞的干預(yù)研究
　　 目的:本研究中，我們采用過表達(dá)ALS疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的細(xì)胞為模型觀察海藻糖對(duì)這些毒性蛋白質(zhì)的自噬性降解有無促進(jìn)作用，并觀察其能否減輕這些蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞帶來的毒性作用。為探索自噬調(diào)控對(duì)ALS病理的影響提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法在NSC-34細(xì)胞系中過表達(dá)WTTDP-43，與家族型ALS相關(guān)的Q331KTDP-43,M337VTD

2、P-43突變蛋白質(zhì)，TDP-43的C末端片段TDP-25和TDP-35，以及人WTSOD1和人突變型SOD1-G93A蛋白質(zhì)。再給予用不同濃度的海藻糖（25mM、50mM和100mM）進(jìn)行干預(yù)。用免疫印跡法檢測(cè)LC3-Ⅱ及P62這兩種自噬通路的標(biāo)記分子以及各種疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。觀察海藻糖對(duì)各類細(xì)胞的過表達(dá)蛋白質(zhì)是否有促進(jìn)清除的作用。并應(yīng)用自噬通路的特異性阻斷劑3-MA和wortmannin來進(jìn)一步驗(yàn)證海藻糖的促蛋白質(zhì)降解作用機(jī)制是否

3、在自噬通路上。應(yīng)用自噬通路中自噬體和溶酶體的融合的阻斷劑bafilomycinA1來明確海藻糖的對(duì)LC3-Ⅱ的上調(diào)作用機(jī)制。免疫印跡的方法和流式細(xì)胞檢測(cè)方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)caspase-3和胞漿CytC的蛋白表達(dá)水平及ROS的水平。
　　 結(jié)果:海藻糖能上調(diào)NSC-34細(xì)胞自噬，使自噬標(biāo)記分子LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)，自噬流的標(biāo)記分子P62的表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)，而且這一促進(jìn)自噬的作用是呈劑量

4、依賴性的，25mM時(shí)就有輕微的促進(jìn)自噬的作用，100mM的劑量下促進(jìn)自噬的作用最強(qiáng)，能使LC3-Ⅱ的表達(dá)含量最高，與之相應(yīng)的，100mM海藻糖降解疾病相關(guān)毒性蛋白質(zhì)的效果也最好。海藻糖可以促進(jìn)TDP-43蛋白質(zhì)兩種突變形式及兩種截短形式TDP-25和TDP-35的降解(P＜0.05)，對(duì)野生型TDP-43的降解無明顯作用（P＞0.05）。海藻糖可以促進(jìn)野生型及突變型SOD1蛋白質(zhì)的降解（P＜0.05）。自噬阻斷劑3-MA和wortman

5、nin均可以阻斷海藻糖上調(diào)LC3-Ⅱ的作用（P＜0.05），同時(shí)可以阻斷其降解TDP-25截短片段的作用(P＜0.05）。在自噬阻斷劑bafilomycinA1的干預(yù)下，海藻糖可以進(jìn)一步上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá)（P＜0.05）。海藻糖可以減少TDP-25毒性片段帶來的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)activecaspase-3和胞漿CytC的表達(dá)（P＜0.05）。海藻糖可以減輕TDP-25毒性片段所致的細(xì)胞ROS的產(chǎn)生(P＜0.05)。
　　

6、結(jié)論:1、海藻糖能誘導(dǎo)過表達(dá)人野生型TDP-43,Q331KTDP-43,M337VTDP-43突變型以及TDP-25,TDP-35兩種毒性截短片段的NSC-34細(xì)胞自噬。其作用有劑量依賴性，100mM用量促進(jìn)自噬作用最強(qiáng)。
　　 2、海藻糖上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá)是因?yàn)槠湓黾恿俗允审w生成而非阻斷了自噬體和溶酶體的融合。
　　 3、海藻糖能夠促進(jìn)Q331KTDP-43,M337VTDP-43兩種突變型以及兩種毒性截短片段TD

7、P-25,TDP-35的降解，對(duì)野生型TDP-43無明顯降解作用。
　　 4、海藻糖能使減少TDP-25毒性片段所致的細(xì)胞凋亡損傷及線粒體損傷。
　　 第二部分:海藻糖對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠突變SOD1的自噬性降解及炎癥反應(yīng)的干預(yù)研究
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，給予其2％海藻糖短期干預(yù)一個(gè)月，觀察海藻糖能否對(duì)小鼠的自噬相關(guān)生化指標(biāo)產(chǎn)生影響。

8、為下一步長(zhǎng)期用藥對(duì)生存期觀察實(shí)驗(yàn)提供體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)以肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠為動(dòng)物模型，應(yīng)用美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室提供的引物序列和鑒定方法對(duì)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠進(jìn)行PCR鑒定并觀察過表達(dá)人突變型轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠的表型特征。免疫印跡法檢測(cè)自噬的標(biāo)記分子LC3-Ⅱ及P62的表達(dá)以及小鼠腰髓人突變型SOD1蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。免疫熒光染色及免疫印跡法檢測(cè)海藻糖對(duì)轉(zhuǎn)基因G93A-

9、SOD1小鼠脊髓前角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有何影響。
　　 結(jié)果:海藻糖干預(yù)組的轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓LC3-Ⅱ表達(dá)含量明顯升高（P＜0.05），自噬流的標(biāo)記分子P62表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。給予海藻糖的轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中突變SOD1蛋白的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。給予海藻糖后小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物CD11B和星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprot

10、ein,GFAP）表達(dá)含量明顯降低（P＜0.05）。免疫熒光染色顯示對(duì)照組轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1和星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP免疫陽(yáng)性較非轉(zhuǎn)基因小鼠明顯增強(qiáng)，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞胞體增大，突起增粗增多。提示膠質(zhì)細(xì)胞處于激活增生狀態(tài)。而給予海藻糖干預(yù)的轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的狀態(tài)被明顯抑制。
　　 結(jié)論:1、海藻糖能上調(diào)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠脊髓組織中的自噬通路。

11、>　　 2、海藻糖能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中突變SOD1蛋白質(zhì)的清除。
　　 3、海藻糖能夠減輕轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活化。
　　 第三部分:海藻糖對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠病程進(jìn)展及行為學(xué)的干預(yù)研究
　　 目的:本研究中，應(yīng)用肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，觀察海藻糖對(duì)小鼠ALS疾病進(jìn)程和運(yùn)動(dòng)功能的改善作用，并對(duì)其作用

12、機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1雌鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，長(zhǎng)期應(yīng)用2％海藻糖至小鼠疾病終末期。觀察長(zhǎng)期應(yīng)用海藻糖對(duì)小鼠體重，神經(jīng)功能評(píng)分有無影響。并聯(lián)合轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)及吊籠實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)長(zhǎng)期應(yīng)用海藻糖對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響。用免疫印跡法檢測(cè)終末期小鼠腰髓自噬相關(guān)標(biāo)記分子LC3-Ⅱ、P62以及人突變型SOD1的表達(dá)變化。用免疫熒光染色和免疫印跡法檢測(cè)海藻糖對(duì)終末期小鼠腰髓中小膠質(zhì)細(xì)胞和星

13、形膠質(zhì)細(xì)胞增生情況的影響。用免疫組織化學(xué)法NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，計(jì)數(shù)終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量。
　　 結(jié)果:海藻糖應(yīng)用2個(gè)月余對(duì)轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠的體重有較輕微的減輕作用，這種減輕作用在絕大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用海藻糖后，小鼠發(fā)?。瓷窠?jīng)功能評(píng)分1）的時(shí)間推遲了4天（對(duì)照組94.43±1.53天;海藻糖干預(yù)組98.71±1.46天;P＜0.05），達(dá)到評(píng)分2的時(shí)

14、間推遲了6天（對(duì)照組111.57±2.22天;海藻糖干預(yù)組，117.93±2.43天;P＜0.05），兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小鼠達(dá)到評(píng)分3及疾病終末期的時(shí)間（即達(dá)到神經(jīng)功能評(píng)分4）也分別的推遲了5天和3天（達(dá)到神經(jīng)評(píng)分3:對(duì)照組，126.0±2.84天;海藻糖干預(yù)組，131.5±2.6天;P＞0.05，達(dá)到疾病終末:對(duì)照組，130.93±2.81天;海藻糖干預(yù)組，138.21±3.32天;P＞0.05），但差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠轉(zhuǎn)

15、棒實(shí)驗(yàn)在即第12周至15周（相當(dāng)于神經(jīng)評(píng)分1分至2分期間），尤其是在第98天給藥組小鼠能力明顯好于對(duì)照組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠在第14周至16周（相當(dāng)于神經(jīng)功能評(píng)分4分至2分期間）的吊籠運(yùn)動(dòng)功能，尤其是98天、102天、112天給藥組小鼠轉(zhuǎn)棒運(yùn)動(dòng)能力明顯好于對(duì)照組(P＜0.05)。海藻糖可以顯著提高終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠脊髓LC3-Ⅱ的表達(dá)水平（＜0.05），但不能降低P62及人突變型SOD1的表達(dá)水

16、平（P＞0.05）。免疫組織化學(xué)NeuN染色顯示海藻糖干預(yù)組和對(duì)照組。轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓前腳運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異（P＞0.05）。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光染色及免疫印跡法結(jié)果顯示海藻糖能明顯減輕終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓膠質(zhì)細(xì)胞增生活化的程度。
　　 結(jié)論:1、海藻糖可以延遲轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠的發(fā)病，推遲其病情進(jìn)展到神經(jīng)功能評(píng)分2階段。但不能延遲轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠病情進(jìn)

17、展到神經(jīng)功能評(píng)分3階段，不能延長(zhǎng)小鼠的生存期。
　　 2、海藻糖可以在轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠病程早期改善小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，但這種改善作用隨著病程的進(jìn)展逐漸減弱。
　　 3、海藻糖可以促進(jìn)終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中自噬體的生產(chǎn)，但不能有效降解突變的SOD1蛋白質(zhì)。
　　 4、海藻糖能減輕終末期轉(zhuǎn)基因G93A-SOD1小鼠腰髓中的膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　 5、海藻糖不能減輕終末期轉(zhuǎn)基因G93A-