ALS疾病的脊髓中異常蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾.pdf

1、ALS疾病，又名肌萎縮側(cè)索硬化癥，是一種以運(yùn)動(dòng)神元選擇性損傷的致死性神經(jīng)退變性疾病。每年新發(fā)病率平均值為1.89/10萬，一般在3到5年呼吸衰竭繼而引起死亡。其病理進(jìn)程主要是在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)皮層、腦干以及脊髓區(qū)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐漸減少。然而其確切的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚。
　　目前ALS疾病的發(fā)病機(jī)制主要集中在Cu/Zn過氧化物歧化酶突變、TDP-43蛋白不正常的修飾及異常聚集、氧自由基的增多、谷氨酸受體的活化以及神經(jīng)絲蛋白的異常聚集等。然而

2、這些機(jī)制只占ALS疾病中的一少部分，絕大多數(shù)的機(jī)制以及病因并不十分清楚。并且在不同分型的ALS疾病發(fā)病積極也有交叉，給ALS疾病的研究帶來了復(fù)雜性和挑戰(zhàn)性。
　　蛋白組學(xué)是從蛋白質(zhì)的整體水平上來研究蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，是研究人來疾病的重要方法。因此本研究旨在通過利用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)，研究ALS病人神經(jīng)系統(tǒng)組織蛋白表達(dá)和修飾的差異，進(jìn)一步闡明ALS疾病可能的發(fā)病機(jī)制，為ALS疾病的早期診斷和治療提

3、供依據(jù)。
　　目的：
　　通過利用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，觀察蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾在ALS疾病不同神經(jīng)系統(tǒng)部位的不同，并進(jìn)一步探討和闡明ALS疾病的可能的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1．使用一維電泳和二維電泳來觀察組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異點(diǎn)，并分離提純的蛋白。
　　2．質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）鑒定差異點(diǎn)的蛋白質(zhì)以及氨基酸片段上可能的集團(tuán)修飾，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（MASOC）搜索。
　　3．Wester

4、nblot以及二維Westernblot進(jìn)一步驗(yàn)證各種蛋白質(zhì)表達(dá)上的差異以及可能的蛋白修飾。
　　結(jié)果：
　　1．通過對(duì)采取病人死后不同部位標(biāo)本組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)二維電泳分析，在脊髓組織中病人和正常人蛋白質(zhì)表達(dá)的差異最大。且呈現(xiàn)不同的電荷的變化。
　　2．質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）鑒定出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)是以GFAP為主，并且在ALS疾病病人的脊髓組織高表達(dá)。除此之外，還包括NFL、波形蛋白（Vimentin）等不

5、同被鑒定的差異蛋白點(diǎn)。通過Westernblot證實(shí)NFL在ALS病人中是低表達(dá)，而Vimentin在ALS疾病高表達(dá)，且在ALS疾病被降解成許多片段。
　　3．GFAP在ALS表達(dá)Westernblot證實(shí)也呈現(xiàn)明顯差異，并且表達(dá)明顯增多。這與二維電泳結(jié)果基本吻合。然而通過把裂解的組織在磷酸緩沖液中透析。析出的沉淀做Westernblot分析降解的片段在疾病組織明顯增多。4．MS/MS數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：GFAP的氨基酸片段上被氧

6、化的部位隨著分子量的減少而呈現(xiàn)增多趨勢(shì)，氨基酸中的蛋氨酸被高度氧化。用乙酰化的抗體對(duì)正常組織和疾病組織免疫結(jié)合發(fā)現(xiàn)，其乙?；牡鞍滓膊槐M相同。通過MS/MS鑒定出三種已知蛋白：Tublin,GFAP和UBS3A。
　　結(jié)論：
　　本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來探索ALS疾病可能的發(fā)病機(jī)制；研究結(jié)果提示細(xì)胞骨架蛋白可能在ALS疾病的病理發(fā)展過程中，起著重要的作用。GFAP的異常表達(dá)，以及氧化修飾給ALS疾病發(fā)病的機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供了新