甲基丙二酸血癥基因新突變功能及神經(jīng)元凋亡機(jī)制研究.pdf

1、第一部分甲基丙二酰輔酶A變位酶基因新錯義突變功能研究
　　目的:對8種甲基丙二酰輔酶A變位酶(methylmalonyl-CoA mutase，MCM)基因(MUT)的變異進(jìn)行MCM蛋白表達(dá)量和酶活性的分析，驗證這8種突變的致病性。
　　方法:(1)選取8例甲基丙二酸血癥患者的8種未報道的MUT基因錯義突變(L140P、A141T、G161V、W309G、、 I505T、Q514K、I597R及G723D)，利用生物信息學(xué)軟

2、件預(yù)測這些突變對MCM蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響;(2)構(gòu)建攜帶野生型及這8種突變型MUT cDNA的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞;(3)Western blot檢測野生型及突變型MCM蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)量;(4) UPLC檢測293T細(xì)胞中野生型及突變型MCM酶活性。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了含MUT cDNA的野生型和8種突變型(L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D

3、)表達(dá)載體;(2) RealtimePCR結(jié)果顯示8種錯義突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞MUT基因mRNA水平與野生型比較無顯著差異(P＞0.05);(3) western blot結(jié)果提示5種錯義變異（L140P、 A141T、G161V、W309G及Q514K）較野生型MCM蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)，而I505T、1597R及G723D與野生型相比較無差異(P＞0.05);(4) UPLC結(jié)果提示8種錯義突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后29

4、3T細(xì)胞的MCM蛋白酶活性(0.31±0.21、1.66±0.01、0.76±0.04、0.19±0.13、1.37±0.24、0.46±0.09、0.86±0.27和1.37±0.13nmol/min/mg protein)均較野生型（3.11±0.13 nmol/min/mg protein）減低（P均＜0.05）;(5)結(jié)合患者臨床表型分析，證實這8種MUT基因錯義突變均為致病突變。
　　結(jié)論:MUT基因的8種錯義突變(L1

5、40P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D)均未影響mRNA表達(dá)水平，其中5種突變導(dǎo)致MCM蛋白表達(dá)量降低，8種突變均導(dǎo)致MCM酶活性下降，均被證實為致病突變。
　　第二部分小鼠腦神經(jīng)元經(jīng)MMA誘導(dǎo)后凋亡變化及LncRNA表達(dá)與凋亡信號通路中相關(guān)mRNA關(guān)系分析
　　目的:通過表達(dá)譜芯片對甲基丙二酸(methylmalonic acid，MMA)誘導(dǎo)的原代小鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行檢

6、測，篩選與神經(jīng)元凋亡相關(guān)的差異表達(dá)長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）及mRNA，分析LncRNA與凋亡信號通路中相關(guān)mRNA的關(guān)系，探討MMA腦損傷的部分機(jī)制。
　　方法:(1)利用不同濃度的甲基丙二酸誘導(dǎo)小鼠原代皮層神經(jīng)元6h、12h及24h，觀察神經(jīng)元凋亡情況;(2)通過表達(dá)譜芯片檢測甲基丙二酸誘導(dǎo)下差異表達(dá)的LncRNA及mRNA;(3)對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能富集(GO)分析及Path

7、way分析，分析與凋亡相關(guān)的LncRNA及mRNA;(4)分析LncRNA參與甲基丙二酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能途徑。(5)分析LncRNA與凋亡信號通路中相關(guān)mRNA的關(guān)系.
　　結(jié)果:(1)小鼠神經(jīng)元經(jīng)甲基丙二酸誘導(dǎo)后，呈現(xiàn)濃度及時間依賴性凋亡現(xiàn)象;(2)表達(dá)譜芯片篩選出與甲基丙二酸作用呈表達(dá)遞增趨勢的LncRNA113條，mRNA248條;表達(dá)呈遞減趨勢的LncRNA61條，mRNA191條，這些基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞增殖與凋

8、亡等功能相關(guān);(3) Pathway分析結(jié)果顯示22條mRNA包含在MAPK信號通路;8條mRNA包含在P53信號通路;(4)包含在MAPK信號通路中的Atf4，、Dusp8、Hspa2等7條mRNA的表達(dá)與LncRNA呈顯著相關(guān);(5)6條LncRNA(NONMMUT041857，KnowTID_00005724，NONMMUT001282、 NONMMUT044301、 NONMMUT006249、NONMMUT062897)與At

9、f4表達(dá)顯著相關(guān);(6) LncRNA可能通過調(diào)控Atf4的表達(dá)激活了MAPK信號通路中的一系列凋亡相關(guān)基因（p-JNK、c-Jun及p-Akt等）的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。
　　結(jié)論:(1)本研究進(jìn)一步證實了MMA腦損傷機(jī)制之一為腦神經(jīng)元凋亡;(2)MMA誘導(dǎo)的腦神經(jīng)元凋亡途徑可能通過MAPK及P53信號通路;(3) LncRNA可能通過調(diào)控Atf4差異表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控MAPK信號通路，參與MMA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，為進(jìn)一步研究MM