CD3bright CD56+ T細(xì)胞參與慢性HBV病人干擾素治療無應(yīng)答和不同NK細(xì)胞中miRNA調(diào)控研究.pdf

1、第一部分HBV治療臨床研究
　　乙肝病毒(HBV)感染在全世界范圍普遍存在，雖然乙肝疫苗早在上世紀(jì)八十年代開發(fā)并應(yīng)用，但全球仍有3.5億人是慢性乙肝病毒攜帶者。而中國(guó)更是乙肝病毒感染大國(guó)，有接近1億人次。慢性乙肝病毒感染(CHB)嚴(yán)重影響著大眾的健康，患者有較高的風(fēng)險(xiǎn)罹患肝臟相關(guān)疾病，包括肝臟代謝失調(diào)、肝纖維化、肝硬化、嚴(yán)重者甚至發(fā)生原發(fā)性肝癌。因此，尋找有效的方法治療慢性HBV感染非常重要。
　　乙肝病毒在肝臟中的復(fù)制是導(dǎo)

2、致肝損傷和疾病的重要原因，所以控制乙肝病毒的病毒載量和相關(guān)抗原的表達(dá)成為治療的主要手段。目前為止，臨床普遍應(yīng)用的乙肝感染治療方法分為三類，長(zhǎng)效干擾素;核苷/核苷類似物抗病毒藥物;干擾素聯(lián)合抗病毒藥物治療。其中長(zhǎng)效干擾素具有免疫調(diào)節(jié)的活性，治療效果相對(duì)較好。然而對(duì)于e抗原陽(yáng)性的CHB病人，48w的peg-IFNα治療后持續(xù)應(yīng)答率僅占30％左右。乙肝臨床治療效果很差，直接反應(yīng)了機(jī)體（尤其是肝臟）的免疫系統(tǒng)免疫應(yīng)答功能發(fā)生失調(diào)。
　　C

3、D56+T細(xì)胞在肝臟中所占T細(xì)胞的比例高達(dá)50％，可以通過分泌IFNγ抑制HBV病毒復(fù)制。而且CD56+T細(xì)胞是抗病毒因子IFNγ的重要來源，甚至多于NK細(xì)胞，是主要的抗病毒免疫細(xì)胞。然而HBV感染后干擾素治療效果較差，提示我們擁有抗病毒的效應(yīng)CD56+T細(xì)胞可能存在不同的狀態(tài)，并且在HBV感染和治療過程中處于相對(duì)抑制狀態(tài)。
　　因此，課題研究目的是探究CD56+T細(xì)胞群體在HBV病人感染及治療過程中的作用，揭示長(zhǎng)效peg-IFN

4、α臨床治療慢性HBV感染效果不佳的原因，同時(shí)希望為HBV臨床治療提供一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　基于以上研究目的，臨床選取了85例HBeAg陽(yáng)性的慢性HBV感染病人，通過Peg-IFNα持續(xù)治療48w，之后隨訪觀察24w。在不同時(shí)間點(diǎn)(0w、12w、24w、36w、48w、60w、72w)對(duì)病毒學(xué)指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)。經(jīng)過系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)和整理分析,取得了以下研究結(jié)果:
　　1、慢性HBV感染病人多數(shù)呈現(xiàn)CD3brightCD56

5、+T細(xì)胞狀態(tài)
　　CD56+T細(xì)胞在抵抗病毒感染的同時(shí)，可能發(fā)揮著免疫調(diào)控作用。為了進(jìn)一步研究CD56+T細(xì)胞在CHB病人中的狀態(tài)，通過流式細(xì)胞術(shù)的方法分析了HBV病人和正常人外周血的CD56+T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV病人相比于正常人，外周血CD56+T細(xì)胞的CD3熒光強(qiáng)度表達(dá)明顯較高。根據(jù)CD56+T細(xì)胞上CD3的熒光強(qiáng)度表達(dá)，把病人分為兩種類型，一種是擁有CD3brightCD56+T細(xì)胞的CHB病人，一種是擁有CD3dimCD

6、56+T細(xì)胞的CHB病人。在所有的85例CHB病人中，64.7％(55/85)比例呈現(xiàn)CD3brightCD56+T細(xì)胞類型;對(duì)應(yīng)的，正常人33例樣本中，30.3(10/33)比例呈現(xiàn)CD3brightCD56+T細(xì)胞類型。以上結(jié)果顯示CHB病人多數(shù)呈現(xiàn)CD3brightCD56+T細(xì)胞狀態(tài)。
　　2、擁有CD3brightCD56+T細(xì)胞類型的CHB病人臨床治療效果較差
　　接下來探究CHB病人CD3brightCD56+

7、T細(xì)胞類型的存在是否與臨床干擾素治療效果有相關(guān)性。首先，在所有的69例有完整臨床治療數(shù)據(jù)的CHB病人中，發(fā)現(xiàn)擁有CD3brightCD56+T細(xì)胞類型的CHB病人臨床指標(biāo)處于相對(duì)偏高狀態(tài)。其次，很大比例(89.4％)的擁有CD3brightCD56+T細(xì)胞類型的CHB病人干擾素治療48w之后呈現(xiàn)無持續(xù)應(yīng)答狀態(tài)，相比之下，僅有59.1％的擁有CD3dimCD56+T細(xì)胞類型的CHB病人呈現(xiàn)無應(yīng)答。最后，無應(yīng)答病人的CD56+T細(xì)胞多呈現(xiàn)C

8、D3熒光強(qiáng)度較高的狀態(tài)。以上結(jié)果說明擁有CD3brightCD56+T細(xì)胞類型的CHB病人多數(shù)呈現(xiàn)對(duì)干擾素?zé)o應(yīng)答。
　　3、CD3brightCD56+T細(xì)胞低表達(dá)CD8分子
　　根據(jù)擁有CD3brightCD56+T細(xì)胞的乙肝病人臨床治療效果差，猜測(cè)CD3brightCD56+T細(xì)胞應(yīng)該處于功能相對(duì)低下狀態(tài)。分析了一些功能性相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)了CD8分子在CD3brightCD56+T細(xì)胞的表達(dá)明顯低于在CD3dimCD56+

9、T細(xì)胞的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾素治療不會(huì)改變CD3brightCD56+T細(xì)胞低表達(dá)CD8分子的狀態(tài)。從治療效果角度，無應(yīng)答病人CD56+T細(xì)胞表達(dá)CD8分子也相對(duì)較低。總之，干擾素治療的整個(gè)過程，CD3brightCD56+T細(xì)胞均低表達(dá)CD8分子，而無應(yīng)答病人擁有較少的CD8+CD56+T細(xì)胞。
　　4、CD3brightCD56+T細(xì)胞高表達(dá)NKG2A/CD94分子
　　為了進(jìn)一步研究CD3brightCD56+T

10、細(xì)胞是否處于抑制狀態(tài)，檢測(cè)了一些NK細(xì)胞及T細(xì)胞領(lǐng)域的抑制性分子的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)NKG2A/CD94分子在CD3brightCD56+T細(xì)胞的表達(dá)明顯高于在CD3dimCD56+T細(xì)胞的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干擾素治療不會(huì)改變CD3brightCD56+T細(xì)胞高表達(dá)抑制性二聚體NKG2A/CD94的狀態(tài)。從治療效果角度，無應(yīng)答病人CD56+T細(xì)胞表達(dá)NKG2A/CD94分子也相對(duì)較高。總之，干擾素治療的整個(gè)過程，CD3brightCD5

11、6+T細(xì)胞均高表達(dá)NKG2A/CD94分子，而無應(yīng)答病人擁有較少的NKG2A/CD94+CD56+T細(xì)胞。
　　5、CD3brightCD56+T細(xì)胞抗病毒能力較差
　　研究報(bào)道IFNγ對(duì)于機(jī)體抗病毒應(yīng)答非常重要，而peg-IFNα可以誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。根據(jù)前面結(jié)果所觀測(cè)的表型，預(yù)測(cè)CD3brightCD56+T細(xì)胞抗病毒能力較差。通過體外刺激CHB病人的CD3brightCD56+T細(xì)胞和CD3dimCD56+

12、T細(xì)胞，檢測(cè)分泌IFNγ和CD107a的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)CD3brightCD56+T細(xì)胞分泌IFNγ和CD107a的能力均較弱。并且干擾素治療不會(huì)改變CD3brightCD56+T細(xì)胞低表達(dá)抗病毒細(xì)胞因子的狀態(tài)。由此，證明CD3brightCD56+T細(xì)胞抗病毒能力相對(duì)較差。
　　6、peg-IFNα過程中，CD3brightCD56+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)迅速上升
　　在CHB病人中，Tim-3分子高表達(dá)可以抑制很多效應(yīng)細(xì)胞

13、的功能發(fā)揮，包括NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等。然而，干擾素治療之前，Tim-3在CD3brightCD56+T細(xì)胞和CD3dimCD56+T細(xì)胞表面的表達(dá)并沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別。反而在peg-IFNα治療的過程中，CD3brightCD56+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)迅速上升，而CD3dimCD56+T細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)平穩(wěn)。Tim-3在CD3brightCD56+T細(xì)胞表面的變化與IFNγ有很明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此，推測(cè)CD3brightCD

14、56+T細(xì)胞的功能抑制性分子Tim-3在干擾素治療后迅速表達(dá)上調(diào)，可能導(dǎo)致了CD56+T細(xì)胞表現(xiàn)出來的功能缺失，IFNγ分泌降低。
　　綜上所述，第一個(gè)發(fā)現(xiàn)了慢性HBV感染病人中存在一群CD3brightCD56+T細(xì)胞，表型和功能上處于抑制狀態(tài)。這群細(xì)胞的存在與臨床干擾素應(yīng)答低下密切相關(guān)，大比例的CD3brightCD56+T細(xì)胞類型CHB病人為干擾素?zé)o應(yīng)答，可以作為一個(gè)輔助的干擾素應(yīng)答情況的預(yù)測(cè)指標(biāo)。另外，干擾素治療過程中，T

15、im-3在CD3brightCD56+T細(xì)胞迅速上調(diào)，可能是CD56+T細(xì)胞功能失調(diào)的重要原因，部分的解釋了CHB病人干擾素治療效果差的原因。
　　第二部分NK細(xì)胞基礎(chǔ)研究
　　NK細(xì)胞是生物機(jī)體抗腫瘤和感染第一防線。不同組織器官中，NK細(xì)胞表現(xiàn)出不同的發(fā)育和功能狀態(tài)。比如，蛻膜組織中存在相對(duì)未成熟、以產(chǎn)生細(xì)胞因子為主的CD56bright NK細(xì)胞;外周循環(huán)中存在相對(duì)成熟、以發(fā)揮殺傷效應(yīng)為主的CD56dim NK細(xì)胞。

16、r>　　microRNA，是一類非編碼短小RNA，生物機(jī)體內(nèi)起著非常廣泛的調(diào)控作用。已有一些研究報(bào)道了miRNA調(diào)控NK細(xì)胞的發(fā)育和功能，但是研究不同狀態(tài)NK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)調(diào)控的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。
　　這部分工作，研究重點(diǎn)放在三種不同NK細(xì)胞—外周血NK(pNK)、臍血NK(cNK)、蛻膜NK（dNK）—miRNA特異性表達(dá)和差異表達(dá)的研究。并據(jù)此，發(fā)現(xiàn)miR-362-5p是NK細(xì)胞功能調(diào)控的一個(gè)重要miRNA。具體結(jié)果展

17、開如下:
　　1、NK細(xì)胞特異性表達(dá)miRNA分析
　　對(duì)不同淋巴細(xì)胞的miRNA基因芯片進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了dNK、cNK和pNK細(xì)胞特異性高表達(dá)差異兩倍以上的miRNA;進(jìn)一步分析，揭示了在三種NK細(xì)胞中均高表達(dá)兩倍以上的七個(gè)miRNA，其中之一是miR-362-5p。
　　2、NK細(xì)胞間差異表達(dá)miRNA分析
　　接下來，又對(duì)三種不同狀態(tài)NK細(xì)胞間進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析。在三種NK細(xì)胞間兩兩比對(duì)，發(fā)現(xiàn)dN

18、K與pNK細(xì)胞差異最明顯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-362-5p在pNK細(xì)胞高相對(duì)表達(dá)，表明miR-362-5p可能參與NK細(xì)胞功能的調(diào)控。
　　3、CYLD是NK細(xì)胞中miR-362-5p的靶基因
　　根據(jù)以上結(jié)果，選定miR-362-5p作為研究對(duì)象。首先需要確定miR-362-5p在NK細(xì)胞中發(fā)揮功能的靶基因。應(yīng)用TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-362-5p潛在的靶基因，通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了CYLD是miR-362

19、-5p直接作用的靶基因，PCR和蛋白印記方法進(jìn)一步證明了在NK細(xì)胞內(nèi)miR-362-5p同樣可以調(diào)控CYLD的表達(dá)。
　　4、過表達(dá)或者抑制miR-362-5p可以通過CYLD調(diào)控NK細(xì)胞的功能
　　接下來研究miR-362-5p對(duì)NK細(xì)胞的作用，通過核轉(zhuǎn)染的方法向蛻膜NK細(xì)胞中導(dǎo)入miR-362-5p的模擬物，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)NK細(xì)胞的相關(guān)效應(yīng)功能;又向外周血NK中導(dǎo)入miR-362-5p的抑制劑敲低miR-362-5p，結(jié)果

20、發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞殺傷功能和分泌細(xì)胞因子能力明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-362-5p對(duì)于NK細(xì)胞的功能調(diào)控是通過靶向CYLD實(shí)現(xiàn)的。該結(jié)果顯示了miR-362-5p可以正向調(diào)控NK細(xì)胞發(fā)揮功能。
　　綜上所述，我們的工作提供了不同狀態(tài)NK細(xì)胞（dNK、cNK、pNK）中miRNA的表達(dá)特異性，為日后不同NK細(xì)胞亞群中分子調(diào)控的研究提供了便利。另外，發(fā)現(xiàn)了miR-362-5p可以調(diào)控NK細(xì)胞功能。研究為NK細(xì)胞miRNA調(diào)控研究提供了