HBV感染慢性化進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象及其相關(guān)發(fā)生機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　HBV感染慢性化進(jìn)程中，CD4+T細(xì)胞發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用，并因其亞群多樣性可對(duì)肝纖維化進(jìn)程產(chǎn)生不同的影響。前期研究中發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者體內(nèi)， Treg/Th17比率隨著肝損傷和肝纖維化程度加深而降低。而T淋巴細(xì)胞本身也存在一個(gè)被調(diào)節(jié)的過程，T淋巴細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡是免疫調(diào)節(jié)的主要途徑，包括細(xì)胞凋亡(apoptosis)與自噬(autophagy)等。其中自噬是胞內(nèi)雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)

2、等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。有研究認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞及其亞群通過自噬來達(dá)到免疫穩(wěn)態(tài)。近年來，實(shí)質(zhì)細(xì)胞的自噬在病毒感染、腫瘤疾病進(jìn)展以及藥物抵抗等方面的研究已經(jīng)取得一定程度的進(jìn)展。而新近報(bào)道，在HIV感染中發(fā)現(xiàn)存在CD4+T細(xì)胞的自噬現(xiàn)象，那么在HBV感染慢性化進(jìn)程中是否存在CD4+T細(xì)胞自噬功能的改變、改變受肝臟微環(huán)境何種因

3、素影響及相關(guān)的信號(hào)通路尚不明確。
　　方法：
　　1.HBV感染慢性化進(jìn)程中的CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象觀察
　　分離攜帶者、慢性乙型肝炎(CHB)及乙肝后肝硬化(LC)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，流式細(xì)胞術(shù)分選純化患者外周血CD4+T細(xì)胞。采用電鏡觀察CD4+T細(xì)胞自噬過程中的包裹胞內(nèi)容物的雙層膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平明確疾病進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬功能的改變;采用細(xì)胞免疫熒光法直觀檢測CD4+T細(xì)胞中LC3B(

4、microtubule-associated protein1 light chain3)的定位及表達(dá)。采用多色流式細(xì)胞術(shù)(指標(biāo)包括CD4、LC3B)，分析外周血CD4+T細(xì)胞自噬活動(dòng)的表達(dá)情況，以及Western blot分析疾病進(jìn)程中CD4+T細(xì)胞自噬特異性蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相關(guān)蛋白（Atg5、Atg7和Beclin-1）以及降解蛋白p62變化情況。
　　2.CD4+T細(xì)胞自噬活動(dòng)影響因素的體外研究
　　ELISA檢

5、測慢性乙型肝炎患者體內(nèi)血清HMGB1表達(dá)，并對(duì)HMGB1與外周血CD4+T細(xì)胞自噬做相關(guān)性分析:收集不同分級(jí)分期的慢性乙型肝炎患者肝穿刺標(biāo)本，采用免疫組化法分析肝臟HMGB1表達(dá);免疫熒光法檢測局部CD4+T細(xì)胞的自噬特異性蛋白表達(dá)，從組織學(xué)水平證實(shí)肝組織局部CD4+T細(xì)胞的自噬現(xiàn)象。利用HBcAg、 r-HMGB1刺激CHB組（病理分期S2～3及S4）患者外周血分離出的CD4+T細(xì)胞，多色流式細(xì)胞術(shù)檢測這兩種代表HBV感染慢性化進(jìn)程中

6、的不同致病因素對(duì)CD4+T細(xì)胞自噬功能的影響;采用序貫刺激方法，模擬疾病進(jìn)展，進(jìn)一步觀察其對(duì)CD4+T細(xì)胞自噬活動(dòng)的改變;自噬與凋亡關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，為了更純粹的分析細(xì)胞自噬的相關(guān)影響因素，我們利用AnnexinV-PI染色分析細(xì)胞凋亡情況。
　　3.HMGB1影響CD4+T細(xì)胞自噬功能的信號(hào)通路研究
　　HMGB1刺激CD4+T細(xì)胞前后，流式細(xì)胞術(shù)檢測HMGB1受體的表達(dá)量（指標(biāo)包括TLR2、TLR4、RAGE），分析刺激物是

7、否改變受體表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色檢測HMGB1下游的信號(hào)分子磷酸化表達(dá)情況(指標(biāo)包括p-JNK、p-AKT、p-P38、p-ERK);加入相關(guān)受體拮抗劑或信號(hào)分子拮抗劑后，流式細(xì)胞術(shù)分析LC3B表達(dá)量以及上述信號(hào)分子的磷酸化表達(dá)情況，分析受體以及介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)自噬活動(dòng)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.HBV感染慢性化進(jìn)程中的CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象觀察
　　多色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:外周血LC3/CD4+T比值（即CD

8、4+T細(xì)胞中發(fā)生自噬活動(dòng)的細(xì)胞比例），在HBV感染慢性化進(jìn)程中持續(xù)升高，而慢性乙型肝炎進(jìn)展至肝硬化階段，其CD4+T細(xì)胞自噬水平下降。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明，自噬特異性蛋白(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)以及相關(guān)蛋白(Atg5、Atg7和Beclin-1)表達(dá)量在疾病進(jìn)展中逐漸增加，CHB進(jìn)展至LC階段表達(dá)下調(diào)，而自噬降解蛋白p62的表達(dá)與上述蛋白趨勢恰好相反，表明無論流式細(xì)胞檢測還是Western蛋白表達(dá)分析，CD4+T細(xì)胞自噬

9、改變趨勢一致。
　　將攜帶者、CHB和LC組，再根據(jù)病毒、炎癥、HBeAg表達(dá)、GS分期進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)HBV病毒載量越高，炎癥程度越高，CD4+T細(xì)胞自噬活動(dòng)增強(qiáng);而臨床上用來一定程度上反應(yīng)病毒復(fù)制的HBeAg指標(biāo)，對(duì)細(xì)胞自噬無明顯改變。對(duì)S2～3期慢乙肝患者按照G分期的不同進(jìn)一步分組后分析發(fā)現(xiàn)，外周血CD4+T細(xì)胞自噬隨著G分期的增加而增加;同樣的對(duì)G2～3期迸一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著S分期（纖維化程度）的增加，外周血CD4+T細(xì)

10、胞自噬表達(dá)也顯著增多，但S4期與S2～3期比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加。而乙肝后肝硬化患者外周血CD4+T自噬現(xiàn)象，隨著Child分期評(píng)分的增加呈現(xiàn)出明顯增高趨勢。
　　2.CD4+T細(xì)胞自噬活動(dòng)影響因素的體外研究
　　慢性乙型肝炎過程中，HMGB1水平隨S分期增加而增高，且與CD4+T細(xì)胞自噬之間存在顯著正相關(guān)，提示HMGB1可能是影響CD4+T細(xì)胞自噬的一個(gè)重要因素。透射電鏡檢測和多色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:單獨(dú)給予HBcAg或

11、HMGB1刺激，CD4+T細(xì)胞自噬表達(dá)增多;給予HBcAg和HMGB1序貫刺激后，CD4+T細(xì)胞自噬表達(dá)較HBcAg單獨(dú)刺激明顯增加，但三組比較，細(xì)胞凋亡活動(dòng)無明顯差異。
　　3.HMGB1影響CD4+T細(xì)胞自噬功能的信號(hào)通路研究
　　HBV感染慢性化進(jìn)程中呢，CD4+T細(xì)胞表面TLR2、TLR4、RAGE表達(dá)均無明顯變化，給予HMGB1刺激后，僅RAGE表達(dá)增多，提示RAGE可能參與HMGB1促進(jìn)自噬。給予RAGE中和性抗

12、體，自噬活動(dòng)相較于HMGB1刺激組減弱，磷酸化JNK/ERK表達(dá)也降低，而p38MAPK和AKT沒有明顯表達(dá)異常。
　　結(jié)論：
　　在HBV感染慢性化進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)存在外周血CD4+T細(xì)胞自噬現(xiàn)象，表現(xiàn)為:CD4+T細(xì)胞自噬水平伴隨CHB患者血清病毒復(fù)制、肝組織炎癥及纖維化炎癥程度加重而增高;同時(shí)，LC患者肝功能Child分期的增加自噬現(xiàn)象愈為明顯。HBV病毒本身(HBcAg)和炎癥因素(HMGB1)均能有效的促進(jìn)外周血CD4+