變鉛鏈霉菌基因磷硫修飾蛋白DndE的表達(dá)純化與結(jié)晶初步探討.pdf

1、DNA磷硫修飾是迄今為止被發(fā)現(xiàn)的第一類發(fā)生在DNA骨架上的生理修飾，其是由dnd基因簇編碼的DndA、DndB、DndC、DndD、DndE蛋白所調(diào)控。根據(jù)生物信息學(xué)分析，DndE蛋白可能是一類NCAIR合成酶的同源蛋白或者是一種PAPS硫轉(zhuǎn)移酶的同源蛋白，這種功能推測(cè)上的模糊性為進(jìn)一步開展DNA磷硫修飾的研究帶來了巨大的困難。因此為了解決這一難點(diǎn)，準(zhǔn)確闡述DndE蛋白的生理功能，我們選擇DndE蛋白作為研究對(duì)象。為了研究DNA磷硫修飾

2、在物種上的保守性和進(jìn)化性，我們選擇了來源于Streptomyceslividans66的DndE蛋白作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　　首先，我們摸索了Streptomyces lividans66 DndE蛋白的表達(dá)純化條件，嘗試了不同的載體和不同的表達(dá)標(biāo)簽，如pET-44b、pSJ7、pET-28a。最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)利用PSMT3載體進(jìn)行異源表達(dá)與純化的時(shí)候，最終可以獲得比較穩(wěn)定的DndEN-flag-livdan蛋白。在獲得穩(wěn)定的DndE

3、蛋白樣品以后，我們對(duì)其開展了一系列功能的研究。研究表明Streptomyces lividans66的DndE蛋白存在構(gòu)象不均一，多聚現(xiàn)象等，且這種多聚與DndE蛋白的濃度有關(guān)系。
　　鑒于DndE蛋白多聚的現(xiàn)象，無法使用NMR技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)的解析，于是我們嘗試用X-ray的方法對(duì)DndE蛋白進(jìn)行結(jié)晶學(xué)研究。在得到比較穩(wěn)定的蛋白樣品后，進(jìn)行了一系列的結(jié)晶篩選和結(jié)晶優(yōu)化，再進(jìn)行晶體條件初篩的時(shí)候得到了一些DndE的晶體，隨即對(duì)一些晶型

4、比較好的晶體進(jìn)行優(yōu)化，可惜的是，由于沒有達(dá)到晶體解析的分辨率，最終沒有得到DndE的晶體結(jié)構(gòu)。
　　根據(jù)最近的文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)在Escherichia coli B7A的DndE蛋白可能是一種骨架新穎的DNA結(jié)合蛋白。于是，我們也猜測(cè)Streptomyces lividans66的DndE蛋白是不是也有可能是一種DNA結(jié)合蛋白，為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了隨機(jī)標(biāo)記的熒光DNA雙鏈小分子(fluorescence polarizatio