HIF-1α調(diào)控TAZ和GLS2對(duì)維持腫瘤干細(xì)胞表型及介導(dǎo)腫瘤放療耐受的機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)腫瘤中有極小一群腫瘤細(xì)胞具有自我更新能力，腫瘤形成能力以及多向分化潛能，在促使腫瘤形成和維持其增殖，以及導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中起必不可少的作用，這部分細(xì)胞被稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞(CSCs)?，F(xiàn)在已有大量文獻(xiàn)報(bào)道在很多不同類(lèi)型的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的存在，而缺氧環(huán)境下HIF1的活化則可上調(diào)腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量以及維持其表型，然而，其中的調(diào)控機(jī)制卻仍不清楚。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，Hippo信號(hào)通路的效應(yīng)因子名為具有PDZ結(jié)合模序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)

2、對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的自我更新以及腫瘤形成發(fā)揮關(guān)鍵作用。TAZ在大于80％的晚期乳腺癌病人中高表達(dá)，但研究表明TAZ編碼基因WWTR1在乳腺癌中的擴(kuò)增不到10％，提示可能有其他調(diào)控機(jī)制參與其中。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)HIF的靶基因與TAZ下游調(diào)控基因有非常高的重合率，這提示我們HIF與TAZ之間可能存在密切的相互調(diào)控關(guān)系。
　　代謝方式的適應(yīng)性改變是腫瘤在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的顯著特征之一。許多參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的癌基因在這一過(guò)程中活化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)

3、胞發(fā)生代謝方式的改變，以幫助它們適應(yīng)外界惡劣的環(huán)境（如放射線和化學(xué)藥物治療），然而除代謝調(diào)控基因以外，放化療也可活化HIF-1的表達(dá)。HIF-1的表達(dá)激活下游基因葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)和丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞代謝方式從有氧氧化向糖酵解轉(zhuǎn)變，同時(shí)限制代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A(acetyl-CoA)的轉(zhuǎn)化生成。乙酰輔酶A的降低使其作為底物參與三羧酸循環(huán)的過(guò)程也被抑制，導(dǎo)致腫瘤用于脂肪酸合成的主要底物從葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝?/p>

4、酰胺?；蛐酒治鼋Y(jié)果顯示在放療耐受的宮頸癌細(xì)胞中谷氨酰胺酶2(GLS2)顯著高表達(dá)，提示我們對(duì)放射線治療產(chǎn)生耐受的腫瘤細(xì)胞可能存在適應(yīng)性的谷氨酰胺代謝活化，然而其潛在調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　目的：
　　1.研究HIF-1α對(duì)乳腺癌干細(xì)胞表型的影響作用，進(jìn)一步探討HIF-1與TAZ之間的相互調(diào)控機(jī)制以及HIF-1通過(guò)作用Hippo信號(hào)通路對(duì)TAZ核轉(zhuǎn)位的影響作用;
　　2.研究HIF-1α對(duì)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞谷氨酰胺代謝重

5、編程誘導(dǎo)放療耐受的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.利用腫瘤基因TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析WWTR1基因與HIF靶基因之間的表達(dá)相關(guān)性。對(duì)于細(xì)胞缺氧處理，采用缺氧小室培養(yǎng)細(xì)胞，室內(nèi)灌入1％氧氣、5％氮?dú)夂?4％二氧化碳。采用免疫組化染色、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)乳腺癌組織及細(xì)胞中TAZ的表達(dá)情況。利用熒光素酶報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)HIF-1對(duì)TAZ以及SIAH1基因啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。利用免疫共沉

6、淀技術(shù)檢測(cè)LATS2和SIAH1之間的蛋白結(jié)合作用。免疫熒光染色用于檢測(cè)TAZ的核定位。采用Aldefluor干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀和乳腺干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)HIF-1和TAZ對(duì)乳腺癌干細(xì)胞表型維持的調(diào)控作用。為高效敲低TAZ，SIAH1和LATS2的蛋白表達(dá)水平，采用慢病毒pLKO.1嘌呤霉素質(zhì)粒編碼的RNA干擾載體，分別與pCMV-dR8.91同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集得到的慢病毒上清液再轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，并采用嘌呤霉素篩選得到有

7、效的干擾細(xì)胞系。運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線及Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析乳腺癌病人雙陽(yáng)性HIF-TAZ靶基因?qū)Ρ入p陰性或單陽(yáng)性HIF-TAZ靶基因的存活率差異。
　　2.研究HIF-1調(diào)控宮頸癌細(xì)胞谷氨酰胺代謝重編程以及其放療耐受產(chǎn)生的機(jī)制，首先采用2 Gy的放射線連續(xù)亞致死劑量照射宮頸癌Hela細(xì)胞株，重復(fù)照射25次，總劑量達(dá)50Gy，總時(shí)長(zhǎng)為6個(gè)月左右。利用免疫組化染色和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GLS2的蛋白

8、表達(dá)水平。建立GLS2慢病毒干擾載體，首先設(shè)計(jì)GLS2-shRNA干擾序列并插入慢病毒pGCL-GFP綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體，并且做后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分別用于檢測(cè)各處理組的放療敏感性變化以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期改變。免疫熒光染色二氫乙錠用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化。比色酶標(biāo)檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)樣本中還原型和氧化性谷胱甘肽的比率差異。NAD+/NADH比率檢測(cè)試劑盒和NADP+/NADPH定量比色分析試劑盒分別用于

9、檢測(cè)NADH和NADPH的水平變化情況。建立小鼠移植瘤模型，對(duì)比不同處理組細(xì)胞的增殖能力。最后，采用免疫組化染色及進(jìn)行GLS2與宮頸癌病人臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.HIF-1和TAZ之間的多重調(diào)控機(jī)制以及其對(duì)乳腺癌干細(xì)胞表型的調(diào)控作用
　　1.1 通過(guò)分析腫瘤病人基因數(shù)據(jù)庫(kù)得出基因表達(dá)熱圖顯示TAZ mRNA表達(dá)水平與隨機(jī)輸入的10個(gè)HIF靶基因呈顯著正相關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR和Westem blo

10、t結(jié)果提示TAZ的mRNA及蛋白表達(dá)水平在5種不同的乳腺癌細(xì)胞株經(jīng)過(guò)缺氧處理后呈顯著高表達(dá)，然而在HIF-1α敲低細(xì)胞株中，TAZ的高表達(dá)受到明顯抑制。利用UCSC基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析TAZ編碼基因WWTR1基因序列中的潛在HIF結(jié)合位點(diǎn)最終得到在此基因反義鏈的第二個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的一段序列5'-GCGTGGCACACA-3'，并且ChIP實(shí)驗(yàn)證明這段序列為HIF-1α和HIF-1β的結(jié)合位點(diǎn)。最后，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)這一結(jié)合位點(diǎn)是否具有功能

11、性，結(jié)果顯示，野生序列載體熒光素酶活性在缺氧條件下顯著升高，而突變序列載體則轉(zhuǎn)錄收到抑制。
　　1.2 敲低TAZ未影響HIF-1α或者HIF-2α的蛋白表達(dá)。通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)證明，敲低HIF-1α或者HIF-1β可影響TAZ與其下游靶基因CTGF的結(jié)合水平。TAZ靶基因CTGF、PAI-1和Survivin的mRNA和蛋白水平在乳腺癌細(xì)胞株缺氧條件下也受HIF-1α的調(diào)控。次外，免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示TA

12、Z在常氧條件下主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中;而缺氧條件下TAZ大量定位在細(xì)胞核中表達(dá)，胞質(zhì)中其分布則相應(yīng)有所下降。
　　1.3 為進(jìn)一步探討缺氧對(duì)于Hippo信號(hào)通路的影響，采用Western blot檢測(cè)其通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)中LATS家族的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)只有LATS2的蛋白水平受到抑制，并且這一過(guò)程為HIF依賴(lài)的調(diào)控方式。分析與缺氧相關(guān)的E3泛素蛋白連接酶發(fā)現(xiàn)其中SIAH1受HIF-1調(diào)控，且LATS2在缺氧環(huán)境下的降解是通過(guò)泛素蛋白酶體降解途

13、徑。進(jìn)一步采用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出HIF-1與SIAH1的HRE結(jié)合位點(diǎn)。
　　1.4 采用Aldefluor干細(xì)胞檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀和乳腺干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)缺氧對(duì)乳腺癌干細(xì)胞干性維持的調(diào)控作用，結(jié)果提示ALDH陽(yáng)性的干細(xì)胞百分比在缺氧條件下顯著升高，干擾HIF-1α或TAZ降低乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量及成球能力。另外，敲低SIAH1或LATS2也能影響乳腺癌干細(xì)胞表型及TAZ細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。進(jìn)一步在動(dòng)物試驗(yàn)中驗(yàn)證這一結(jié)果顯示HIF-1α敲

14、低細(xì)胞的成瘤能力顯著受到抑制。最后，Kaplan-Meier生存分析表明雙陽(yáng)性表達(dá)HIF和TAZ靶基因特征的乳腺癌病人的生存率顯著降低。
　　2.HIF-1對(duì)宮頸癌谷氨酰胺代謝重編程及其所致的腫瘤放療耐受的調(diào)控作用
　　2.1 建立宮頸癌HelaR放療耐受細(xì)胞株，其次采用克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證此細(xì)胞株放療耐受特性的確立。進(jìn)一步通過(guò)基因芯片分析放療耐受細(xì)胞株與敏感細(xì)胞株的基因表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)谷氨

15、酰胺代謝通路及其關(guān)鍵酶GLS2的活化在宮頸癌放療耐受細(xì)胞株中明顯上調(diào)。緊接著干擾GLS2發(fā)現(xiàn)，放療耐受組細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低，放療敏感性增加。此外，對(duì)比放療耐受組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞在接受6 Gy劑量放射線照射后48小時(shí)的細(xì)胞凋亡數(shù)量發(fā)現(xiàn)，GLS2干擾組檢測(cè)到更多的細(xì)胞凋亡量。
　　2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)敲低GLS2顯著增加放射線照射后細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。進(jìn)一步檢測(cè)還原型和氧化型谷胱甘肽的比率發(fā)現(xiàn)，GSH/GSSG比率在放療

16、耐受HelaR細(xì)胞株中顯著呈高比率狀態(tài)，而GLS2敲低細(xì)胞中此比率明顯下降。與GSH相似，檢測(cè)抗氧化劑NADH以及NADPH在不同細(xì)胞組中的水平變化，發(fā)現(xiàn)還原型NADH和NADPH也在放療耐受細(xì)胞株中呈較高水平狀態(tài)，而在GLS2敲低細(xì)胞中其生成明顯下降。
　　2.3 建立小鼠移植瘤模型用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證GLS2對(duì)宮頸癌放療耐受的調(diào)控作用。結(jié)果證明放療耐受的宮頸癌細(xì)胞移植瘤組小鼠腫瘤增殖明顯高于野生宮頸癌細(xì)胞移植瘤組，然而GLS2

17、敲低后，小鼠移植瘤增殖得到抑制。另外，免疫組化染色臨床宮頸癌病人標(biāo)本顯示GLS2在對(duì)放射線治療耐受的病人標(biāo)本中表達(dá)明顯高于放療敏感的病人腫瘤組織。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)一步提示GLS2的表達(dá)與宮頸癌放療敏感性高度相關(guān)。最后，基因表達(dá)相關(guān)性分析表明GLS2 mRNA與HIF靶基因表達(dá)呈顯著正相關(guān)性。實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HIF-1α干擾細(xì)胞中GLS2表達(dá)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.TAZ是HIF-1的靶