RANTES受體在人附睪中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的：
　　附睪上皮不同類型細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，共同維持管腔液的酸性環(huán)境，保持精子處于靜息狀態(tài)而避免其提前獲能。我們的前期研究顯示，受激活調(diào)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted）RANTES主要表達(dá)于人附睪上皮的巨噬細(xì)胞。為進(jìn)一步了解RANTES受體在人附睪的表達(dá)情況以及RANTES是否通過受體在附睪上皮

2、細(xì)胞之間傳遞信號(hào)，本研究首先觀察RANTES受體CCR1、CCR3、CCR5在人附睪的表達(dá)和定位，RANTES在大鼠附睪的細(xì)胞定位；然后建立大鼠附睪微灌注模型，探討RANTES及其受體參與附睪管腔酸環(huán)境調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ reverse transcriptpolymerase chain reaction， RT-PCR）、免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察RANTES受體在

3、人附睪中的表達(dá)及定位，采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察RANTES在大鼠附睪上皮中的細(xì)胞定位。
　　2.建立大鼠附睪在體微灌注模型，附睪尾部管腔分別灌注pH為6.8和7.8的PBS，作用30 min后取材，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測酸堿度變化對附睪尾部RANTES表達(dá)的影響；激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy CLSM）下觀察不同酸堿環(huán)境下V-ATPase在附睪亮細(xì)

4、胞上的分布情況。
　　3.大鼠附睪尾部管腔灌注RANTES重組蛋白，作用30 min后取材，利用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot及CLSM技術(shù)檢測RANTES對附睪尾部V-ATPase及iNOS表達(dá)的影響。
　　4.大鼠附睪尾部管腔灌注RANTES競爭性受體拮抗劑Met-RANTES，作用30 min然后取材，利用實(shí)時(shí)定量PCR、Western-blot及CLSM技術(shù)檢測Met-RANTES對附睪尾部V-ATPase

5、及iNOS表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示RANTES受體CCR1、CCR5在人附睪中有表達(dá)，CCR3無表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示 CCR1表達(dá)于附睪輸出小管的纖毛細(xì)胞、附睪管的頂細(xì)胞和基底部細(xì)胞，CCR5在附睪上皮廣泛表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)進(jìn)一步證實(shí)在輸出小管RANTES與CCR1共存于纖毛細(xì)胞，在附睪頭、體、尾部主要共存于基底部細(xì)胞。RANTES與F4/80在大鼠附睪上皮巨噬細(xì)胞有共定位信號(hào)。
　　2

6、.大鼠附睪尾部灌注pH7.8的PBS后，與對照組（pH6.8）相比，實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot結(jié)果顯示RANTES表達(dá)升高，CLSM結(jié)果顯示附睪上皮亮細(xì)胞頂部V-ATPase聚集增多。
　　3.大鼠附睪尾部給予RANTES刺激后，與對照組（pH6.8 PBS）相比，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組V-ATPase和 iNOS表達(dá)升高，CLSM結(jié)果顯示，附睪上皮巨噬細(xì)胞iNOS陽性信號(hào)增強(qiáng)，亮細(xì)

7、胞頂部V-ATPase聚集增多。
　　4.大鼠附睪尾部灌注Met-RANTES后，與RANTES刺激組相比，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，Met-RANTES組V-ATPase和 iNOS表達(dá)降低，CLSM結(jié)果顯示Met-RANTES組附睪上皮巨噬細(xì)胞iNOS陽性信號(hào)減弱，亮細(xì)胞頂部V-ATPase聚集減少。
　　結(jié)論：
　　1.CCR1、CCR5在人附睪有表達(dá)且與RANTES主要共定位于附睪上皮基

8、底部細(xì)胞，CCR3無表達(dá)，提示RANTES可能通過受體CCR1和CCR5在附睪巨噬細(xì)胞起作用。本研究也證實(shí)了RANTES表達(dá)于大鼠附睪巨噬細(xì)胞。
　　2.大鼠附睪尾部灌注堿性PBS后，RANTES表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)亮細(xì)胞頂部V-ATPase聚集增多，提示RANTES的表達(dá)與附睪管腔酸環(huán)境的改變有關(guān)。
　　3.大鼠附睪尾部給予 RANTES刺激后，巨噬細(xì)胞中 iNOS的表達(dá)增強(qiáng)以及亮細(xì)胞頂部V-ATPase聚集增多，進(jìn)一步說明RA