煙曲霉中調(diào)控胞內(nèi)鐵離子平衡的毒力相關蛋白LeuB和MrsA的功能研究.pdf

1、近幾十年來，隨著免疫缺陷人群的不斷擴大，侵襲性真菌感染呈逐年上升的趨勢。目前，引起廣泛關注的致病真菌主要有白念珠菌，隱球菌和煙曲霉，其中煙曲霉是導致侵襲性肺曲霉病的元兇。煙曲霉是一種腐生型的真菌，其分布廣，產(chǎn)孢強，在環(huán)境中無處不在。由于煙曲霉孢子直徑較小，其很容易被人體吸入肺中。對于正常的人體來說，吸入的孢子很容易被殺滅并清除。但是對于免疫缺陷的患者來說，煙曲霉經(jīng)呼吸道侵染后，體內(nèi)的免疫細胞若不能及時將其清除，這些逃脫免疫的孢子會在患者

2、體內(nèi)萌發(fā)、繁殖，進而導致侵襲性曲霉病。目前臨床上主要的抗真菌藥物有伊曲康唑，伏立康唑，兩性霉素B以及卡泊芬凈等。然而，這些藥物都有其局限性，其中兩性霉素對宿主的副作用較大;卡泊芬凈的抗菌譜窄;而運用最廣泛的伊曲康唑和伏立康唑則很容易產(chǎn)生耐藥性。因此，開發(fā)抗菌活力強，抗菌范圍廣以及毒副作用小的新型抗真菌藥物成為了當務之急，而重中之重是尋找合適的藥靶。
　　鐵離子作為一種重要的微量元素參與了一系列的生物學過程。由于宿主體內(nèi)的鐵多以血紅

3、蛋白以及乳鐵蛋白等形式存在，游離的鐵濃度很低，病原菌如何成功地從宿主體內(nèi)獲取鐵元素是其致病的關鍵。因此，病原菌中調(diào)控鐵離子吸收以及平衡的因子經(jīng)常也是毒力決定子，然而鐵離子平衡調(diào)控有關的機制在煙曲霉中仍知之甚少。
　　本研究論文以煙曲霉為研究材料，利用基因敲除等手段，對煙曲霉中與鐵離子代謝以及毒性都相關的功能基因leuB和mrsA開展了系統(tǒng)的研究，得到了以下結論:
　　1、證實轉錄因子LeuB不僅調(diào)控煙曲霉亮氨酸的合成，同時也

4、調(diào)控鐵離子吸收。leuB的缺失會顯著降低與鐵載體合成、轉運相關基因(sidG，sit1和mirB)的轉錄以及低鐵載體的產(chǎn)生水平，從而影響煙曲霉在低鐵環(huán)境下生長。雙缺leuB和控制鐵離子吸收的轉錄因子hapX,會加劇ΔleuB對低鐵敏感的表型;而雙缺leuB和抑制鐵離子吸收的轉錄因子sreA，則會恢復ΔleuB對低鐵敏感的表型。這些結果均說明亮氨酸合成調(diào)控因子LeuB參與煙曲霉鐵離子吸收調(diào)控。
　　2、低鐵環(huán)境下，leuB的缺失會導

5、致細胞鐵離子吸收降低，leuA轉錄下調(diào)，進而阻礙亮氨酸的合成。而亮氨酸合成的阻斷會使蛋白酶體活力增強從而導致蛋白全局性降解。進一步研究證明LeuB的DNA結合結構域(Zn(Ⅱ)2Cys6)以及其C端對煙曲霉適應低鐵環(huán)境以及維持蛋白穩(wěn)定等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。
　　3、證實線粒體鐵通道m(xù)rsA的缺失會降低煙曲霉適應低鐵以及高鐵環(huán)境的能力。同時，mrsA缺失也會導致sreA轉錄低調(diào)，而受SreA抑制的和鐵離子吸收相關的基因如sidA，m

6、irB，ftrA以及fetC則明顯高調(diào)。這些結果說明，MrsA是煙曲霉調(diào)控胞內(nèi)鐵離子平衡必需的。
　　4、進一步研究發(fā)現(xiàn)mrsA的缺失提高了煙曲霉對氧化應激以及唑類藥物的敏感性，其原因主要是ΔmrsA中ROS積累所致。位點突變實驗證實，MrsA中第38，96以及214位保守的組氨酸位點是煙曲霉應對高鐵，低鐵，氧化應激以及唑類藥物等環(huán)境所必需的。
　　5、小鼠毒性實驗證明煙曲霉中和鐵離子代謝相關的功能基因leuB以及mrsA都