煙曲霉誘導的PKD1-NF-κB通路的激活及相關炎癥因子的表達調控.pdf

1、研究背景:
　　 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是一種腐生孢子，屬于真菌的一種，它對環(huán)境中碳和氮原子的循環(huán)起著重要作用。自然界中，真菌種類有很多種，煙曲霉菌不是最多的一個種類，但是還是廣泛分布于土壤、腐敗的植物空氣中。它的生殖形式是孢子生殖，因此每一個孢子都能產生數(shù)以萬計的小孢子，然后釋放到空氣中。這些小孢子直徑非常小，能夠被人或動物吸入肺泡內。
　　 哺乳動物的免疫系統(tǒng)分為天然免疫和適應性免疫，在

2、免疫系統(tǒng)正常的情況下，機體能清除被吸入的煙曲霉分生孢子，使機體免受疾病的困擾。然而，近些年來由于廣譜抗生素和器官移植后免疫抑制劑的大量使用，各種嚴重的真菌感染（包括煙曲霉感染）人群大量增加。其中最常見的為念珠菌的感染，而已有資料表明曲霉菌的感染比例已逐漸趕超念珠菌的感染，并且曲霉菌的感染所造成癥狀的嚴重程度更甚。煙曲霉分生孢子可侵襲不同的部位，大部分病人可造成呼吸道感染，根據(jù)不同的侵襲部位，可以分為過敏性疾病和侵襲性疾病等等。最嚴重的就

3、是侵襲性肺曲霉病，這是一種嚴重的感染，每年可造成高達50％的死亡，煙曲霉和免疫系統(tǒng)的相互作用與疾病密切相關。
　　 在1997年發(fā)表的《Infection and Immunity》雜志中，印度的Taruna Madan證明了存在于肺上皮中蛋白激酶D通過增加吞噬細胞攝取煙曲霉來抑制煙曲霉的感染。蛋白激酶D是一種具有三個亞型的新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質家族，分為PKD1、PKD2、PKD3。有研究表明PKD1在高溫放線菌-多孢高溫多

4、孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula)引起的過敏性肺炎中起主要作用，并且PKD1的抑制劑對于治療這種肺炎是一種非常有效的手段。文章表明PKD家族蛋白酶可能參與調節(jié)TLR4和TLR5影響細胞因子的分泌，在人類和脊椎動物中，TLRs家族通過MyD88分子誘導PKD1的激活。但是目前我們不知道，在天然免疫過程中煙曲霉是否能夠激活PKD1，并且是否PKD1在煙曲霉誘導的炎癥反應中起作用。
　　 核因子-κB

5、（(nuclear factor-κB)是一個轉錄因子，可以受到細胞因子、細菌等刺激而活化，能參與調控腫瘤發(fā)生、炎癥反應、天然免疫應答等等。大量的證據(jù)表明核因子-κB（(nuclear factor-κB)在天然免疫和適應性免疫中都有著不可或缺的作用。有證據(jù)表明缺乏NF-κB蛋白的小鼠的體內B細胞和T細胞的增殖與激活，B細胞和T細胞的轉變，細胞因子的產生明顯受到影響。另有研究證實NF-κB的抑制劑能夠抑制樹突狀細胞的成熟，而樹突狀細胞是

6、免疫應答的中心環(huán)節(jié)。正常情況下，Toll樣受體可直接或間接的識別進入體內的細菌，被識別后，激活下游的信號分子MyD88，進一步導致受體蛋白TNF受體相關因子6（TRAF6）磷酸化進而激活NF-κB通路。目前PKD1在煙曲霉介導的NF-κB通路的激活及轉錄活性中的作用尚未見報道，因此本文旨在探討其作用，并為下一步研究作用機制奠定基礎，繼而期望能夠找到臨床上治療煙曲霉引起的疾病的方法。
　　 目的:
　　 本研究探討PKD1

7、在煙曲霉介導的NF-κB通路的激活及轉錄活性中的作用，為進一步闡明PKD1在煙曲霉感染引起的煙曲霉病中的作用及作用機制奠定基礎。
　　 方法:
　　 首先將GFP、GFP-PKD1表達質粒分別轉染人肺腺癌上皮細胞A549和HEK293細胞中，分別將滅活的煙曲霉分生孢子(1×105 CFU/mL)于不同時間處理上述兩組細胞，Western blot證實PKD1的過表達，并檢測PKD1的磷酸化活性;其次在A549細胞中分別轉

8、染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以滅活的煙曲霉分生孢子處理細胞30分鐘，分別檢測下游NF-κB通路相關信號分子的磷酸化活性;最后，將NF-κB-luc熒光素酶報告基因及內參照報告質粒海腎熒光素酶(pRL-SV40)共轉染入表達GFP、GFP-PKD1的A549細胞中，兩組細胞在有無煙曲霉分生孢子的作用下處理24小時，收集細胞裂解液，進行雙色熒光素酶活性檢測;過表達或干擾PKD1，在有無煙曲霉分生孢子下刺激24小時，用Trizo

9、l法提RNA，用熒光定量PCR的方法檢測炎癥因子IL-8、TNF-a的變化。
　　 結果:
　　 1、PKD1過表達時間依賴性的增強煙曲霉刺激的A549細胞和HEK293細胞中PKD1的磷酸化活性
　　 將外源性的GFP、GFP-PKD1轉入A549中，轉入24h，檢測有過明顯表達，然后用滅活的煙曲霉分生孢子(1×105 CFU/mL)分別用不同時間處理A549，結果顯示煙曲霉顯著增強GFP-PKD1過表達的A5

10、49細胞中Ser744/748和Ser916位點的磷酸化活性，并且以時間依賴的方式增強PKD1上Ser744/748和Ser916位點的磷酸化活性，煙曲霉分生孢子處理30min，其PKD1上Ser744/748和Ser916位點的磷酸化活性達到穩(wěn)定，60min處理明顯降低，并且我們在HEK293中做同樣處理，結果與A549細胞一樣，表明煙曲霉確實以時間依賴的方式激活外源性表達PKD1的細胞中的磷酸化活性。
　　 2、PKD1的過

11、表達增強煙曲霉刺激的NF-κB通路中IκB和p65(pS276)的磷酸化
　　 我們不知道PKD1是否參與了煙曲霉激活的NF-κB信號通路，所以我們檢測了在過表達PKD1的A549細胞中有無煙曲霉分生孢子的刺激對于NF-κB通路激活的影響，PKD1的過表達明顯增強煙曲霉刺激的pIκB和NF-κB的p65的Ser276的磷酸化激活，而與GFP對照組相比，PKD1的過表達對Ser536的磷酸化活性沒有影響。
　　 3、PKD

12、的抑制劑G(O)6976降低A549細胞中煙曲霉對NF-κB通路的激活作用
　　 利用PKD的抑制劑G(O)6976(1μM)作用于A549細胞1小時，在有無煙曲霉的作用下刺激30min，收集細胞裂解液，用Western blot的方法檢測PKD的磷酸化位點pS744/748，以及IκB的變化。結果顯示，PKD1的磷酸化位點減弱，表明抑制劑有作用，IκB的增加顯示抑制劑G(O)6976降低NF-κB通路的激活作用。
　　

13、 4、敲低PKD1的表達降低煙曲霉對NF-κB信號通路的激活作用
　　 既然PKD1的過表達可明顯增強煙曲霉刺激的NF-κB信號通路的激活，是否敲低PKD1的表達能降低煙曲霉對NF-κB信號通路的激活作用？為了證實上述假設，我們利用Lipofectamine2000分別將siCTL(siRNA對照)、si-PKD1轉染A549細胞中，轉染24h后，血清饑餓24小時，最后兩組細胞分別在有無煙曲霉分生孢子的作用下處理30分鐘，收集細

14、胞裂解液。結果表明，與對照相比，si-PKD1的轉染明顯降低內源性PKD1的表達。與此相一致，敲低內源性PKD1的表達，則明顯降低煙曲霉刺激的A549細胞中pIκB和p65(pS276)的磷酸化活性，而對于p65蛋白的表達沒有影響
　　 5、PKD1的過表達明顯增加煙曲霉刺激的NF-κB的轉錄激活活性
　　 利用雙色熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，將2x NF-κB-luc和海腎熒光素酶報告基因pRL-SV40（內對照）分別共

15、轉染入GFP、GFP-PKD1表達的A549細胞中，轉染12小時后血清饑餓12小時，然后GFP、GFP-PKD1兩組細胞分別進行有無煙曲霉分生孢子處理24小時，細胞裂解液分別進行雙色熒光素酶活性檢測，各組細胞的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值用相對熒光素酶活性(RLU)表示。與GFP對照相比，GFP-PKD1的過表達明顯增加NF-κB的轉錄激活活性，而且也明顯增加煙曲霉刺激的NF-κB的轉錄激活活性。
　　 6、敲低P

16、KD1的表達可以降低煙曲霉介導的NF-κB通路下游的炎癥因子的表達
　　 利用siRNA敲低PKD1的表達，應用熒光定量PCR的方法檢測NF-κB通路下游的炎癥因子的表達。結果表明，敲低PKD1的表達可以降低煙曲霉介導的NF-κB通路下游的炎癥因子IL-8、TNF-a的表達。
　　 結論:
　　 在肺腺癌上皮細胞中，PKD1在煙曲霉刺激的NF-κB信號通路的激活及轉錄活性中起重要作用。PKD1的過表達能增強煙曲霉