百脈根結(jié)瘤信號(hào)途徑中相關(guān)調(diào)控蛋白的功能和作用機(jī)制的研究.pdf

1、氮素是自然界中植物生長(zhǎng)的最主要的限制因子之一。豆科植物與根瘤菌之間的根瘤共生(RNS,root nodule symbiosis)固氮系統(tǒng)是自然界中氮素最直接和經(jīng)濟(jì)的來源,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的意義。然而,共生固氮具有宿主專一性,僅限于豆科植物和極個(gè)別非豆科植物,目前想通過遺傳工程的方法實(shí)現(xiàn)重要谷類作物的共生固氮仍面臨巨大的挑戰(zhàn),有待于共生固氮分子機(jī)理的進(jìn)一步揭示。
　　 根瘤的形成過程可分為根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)生兩個(gè)復(fù)雜

2、的過程。近十年來,以模式豆科植物苜蓿(Medicago truncatula)和百脈根(Lotus japonicus)為材料,在宿主植物中鑒定出一系列與共生相關(guān)的基因,初步建立了共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式圖。其中依賴鈣和鈣調(diào)素的蛋白激酶(CCaMK)和兩個(gè)GRAS類轉(zhuǎn)錄因子(NSP1和NSP2)同時(shí)控制根瘤菌侵染和根瘤器官發(fā)生兩個(gè)過程,并預(yù)測(cè)CCaMK、NSP1和NSP2形成復(fù)合體行使功能,但缺乏明確的生物化學(xué)和分子生物學(xué)證據(jù)。本論文以百脈根為

3、材料,圍繞CCaMK、NSP1和NSP2三個(gè)基因開展了以下三個(gè)方面的工作:
　　 1.分別以CCaMK,CCaMK自磷酸化位點(diǎn)突變形式CCaMK(T265I)和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域CCaMK(1-300aa)為誘餌,篩選百脈根AD-cDNA酵母雙雜交文庫。其中以蛋白激酶結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌鑒定到一個(gè)新蛋白,命名為CIP73(CCaMK interactingprotein of approximately73 kDa)。CIP73開放閱讀框包

4、含2,076個(gè)核苷酸,編碼的蛋白質(zhì)由691個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為73 kD。蛋白質(zhì)序列分析顯示CIP73的N端含有一個(gè)和泛素(ubiquitin)同源的類似Scythe_N結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。只有當(dāng)CCaMK的C端鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和EF hand結(jié)構(gòu)域去除后CCaMK才能與CIP73在酵母細(xì)胞中相互作用。進(jìn)一步的缺失突變分析顯示CCaMK的N端80個(gè)氨基酸(residues80-160)是與CIP73相互作用所必需的。雖然全長(zhǎng)的CCaM

5、K與CIP73在酵母細(xì)胞中沒有檢測(cè)到相互作用,但體外蛋白Pull-down和體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)證明全長(zhǎng)CCaMK與CIP73之間存在相互作用。通過半定量RT-PCR,檢查了CIP73和CCaMK在百脈根不同器官中的表達(dá)情況。相對(duì)于莖和葉,CIP73和CCaMK在根中都大量表達(dá),不同的是CIP73在根瘤中僅檢測(cè)到微弱的表達(dá),而CCaMK在根瘤中大量表達(dá)。接種了根瘤菌后CIP73的表達(dá)和CCaMK相似,有一個(gè)有明顯的表達(dá)量下

6、降的過程。CIP73的C端CIP73(486-691)與GFP的融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞和百脈根毛根細(xì)胞的細(xì)胞核中能檢測(cè)到很強(qiáng)的熒光。更重要的是,在鈣離子和鈣調(diào)素存在的條件下,CCaMK在體外能夠磷酸化CIP73的N端(1—413aa)區(qū)域。RNA干擾(RNAI)降低CIP73的表達(dá)能抑制結(jié)瘤,但對(duì)菌根共生沒有明顯的影響,表明CIP73在結(jié)瘤過程中行使重要功能。
　　 2.百脈根CCaMK的自磷酸化位點(diǎn)突變后,在沒有根瘤菌的情況下

7、能形成自發(fā)根瘤。另一方面,水稻的CCaMK能夠互補(bǔ)百脈根CCaMK失去功能的突變表型,并且水稻CCaMK突變影響菌根共生。為了研究CCaMK在水稻中的共生效應(yīng),分別構(gòu)建了水稻和百脈根CCaMK的自磷酸化位點(diǎn)突變Os T263A和Lj T265I的超表達(dá)(雙CaMV35S)和自身啟動(dòng)子表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入水稻中,收獲了T1代轉(zhuǎn)基因種子。PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和GUS染色鑒定每個(gè)片段均有20多個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因系,但其共生效應(yīng)還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

8、r>　　 3.以NSP2的GRAS結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌,在百脈根AD-cDNA酵母雙雜交文庫中鑒定到一個(gè)與。NSP2相互作用的新蛋白,命名為IPN2(Interacting Protein of NSP2)。IPN2開放閱讀框包含1,074個(gè)核苷酸,編碼的蛋白質(zhì)由358個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為40 kD。蛋白質(zhì)序列分析顯示IPN2的N端含有一個(gè)單個(gè)重復(fù)的MYB類結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域和一個(gè)預(yù)測(cè)的coiled-coil結(jié)構(gòu)域。在酵母中,NSP2的

9、GRAS結(jié)構(gòu)域是和IPN2相互作用所必需的,而IPN2的coiled-coil結(jié)構(gòu)域是和NSP2相互作用所必需的。另外通過體外蛋白Pull-down和體內(nèi)雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NSP2與IPN2之間的相互作用。而且,NSP2與IPN2共定位于百脈根毛根細(xì)胞的細(xì)胞核中。IPN2在酵母細(xì)胞中有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活作用,并且能結(jié)合NIN的啟動(dòng)子。IPN2的mRNA在百脈根不同器官中廣泛表達(dá),并且其啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因毛根的韌皮部特異表