根瘤菌共生信號在豆科植物百脈根中的傳遞及其作用機制的研究.pdf

1、根瘤菌與豆科植物能形成一種特殊的共生體根瘤。根瘤菌與宿主植物共生體系的建立過程涉及到兩者之間復(fù)雜的信號識別、基因表達調(diào)控、能量物質(zhì)的交換等。根瘤菌與宿主植物之間的分子對話首先是在低氮或缺氮的環(huán)境下，宿主植物分泌一種類黃酮類化合物或相關(guān)化合物，該類物質(zhì)能誘導(dǎo)根瘤菌一系列結(jié)瘤基因(nod)的表達并合成根瘤菌信號分子—結(jié)瘤因子(Nodfactor)。結(jié)瘤因子反過來引起宿主植物根毛發(fā)生卷曲，侵入線的形成，開啟與根瘤形成和發(fā)育相關(guān)基因的表達，直至

2、根瘤成熟。然而，根瘤菌結(jié)瘤因子信號在宿主植物中的傳遞過程及其調(diào)控機制還不清楚，本文以模式豆科植物—百脈根(Lotusjaponicus)共生固氮體系為材料，利用生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究技術(shù)，開展了根瘤菌共生信號在宿主植物中傳遞途徑和作用機制的研究。其主要研究結(jié)果如下： 1.利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定了百脈根結(jié)瘤因子受體Lj-NFR1、Lj-NFR5(NFR：Nodfactorreceptorkinase)、共生受體激酶Lj-SymR

3、K(SymRK：SymbiosisReceptor-likeKinase)、離子通道蛋白CASTOR等共生功能蛋白間的相互關(guān)系。結(jié)果表明，這幾個蛋白質(zhì)在酵母雙雜交技術(shù)條件下并無相互作用。 2.以接種百脈根根瘤菌2天、4天、6天、8天、12天的百脈根植株的根組織混合物為材料，抽提總RNA，利用RT-PCR合成cDNA，構(gòu)建了百脈根AD-cDNA酵母雙雜文庫。其庫容量達到2.5x106克隆/3μgDNA，其外源DNA片段大小為0.5

4、-2.0kb。 3.SymRK基因編碼一個類受體激酶蛋白。它由富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(LRR，Leucinerichrepeat)，中間的跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane)，C-末端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(PK，Proteinkinase)所組成。本研究分別以百脈根SymRK蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域和PK結(jié)構(gòu)域為誘餌，篩選百脈根酵母雙雜交AD-cDNA文庫，得到了15種不同類型的與百脈根結(jié)瘤因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的基因。其中包括SIP

5、1(SYmRK-interactingprotein)基因。根據(jù)Blast及生物信息學(xué)分析，SIP1蛋白質(zhì)第126到第217氨基酸殘基為ARID結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由8個α-螺旋和2個β-折疊組成。 4.通過酵母雙雜交以及免疫共沉淀等方法對SIP1蛋白與SymRK-PK蛋白相互作用的研究表明，SIP1與SymRK-PK蛋白相互作用的區(qū)域定位于SIP1蛋白C-末端，其蛋白N端和ARID結(jié)構(gòu)域均不能與SymRK-PK相互作用。對SIP1

6、蛋白自身相互作用的研究結(jié)果表明，SIP1蛋白能形成同源二聚體，而且，SIP1蛋白通過自身C-末端的184個氨基酸殘基相互作用形成同源二聚體，其N-末端的223個氨基酸殘基不參與對二聚體的形成。 5.通過酵母單雜交以及凝膠阻滯的方法，我們證實SIP1蛋白具有結(jié)合DNA的能力，但是它沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，由此確定SIP1蛋白為一個具有DNA結(jié)合功能的轉(zhuǎn)錄因子。SIP1蛋白能結(jié)合起始結(jié)瘤基因(NIN，noduleinception)基因

7、的啟動子序列，不能結(jié)合百脈根鈣離子結(jié)合蛋白(CBP1，calcium-bindingprotein1)基因的啟動子序列，這一結(jié)果說明NIN蛋白是SIP1蛋白所調(diào)控的下游基因。我們截去NIN基因啟動子的-59到-70區(qū)域的序列后，SIP1蛋白不能與NIN基因啟動子剩余區(qū)域結(jié)合，這一結(jié)果表明NIN基因啟動子-59到-70區(qū)域的序列是SIP1蛋白結(jié)合NIN基因啟動子區(qū)域的關(guān)鍵序列。 6.利用RealtimeRT-PCR檢測了SIP1和

8、NIN基因在百脈根中的表達，結(jié)果顯示SIP1在百脈根不同組織(根、莖、葉)中均有表達，但是接種根瘤菌使其表達量顯著增加。而NIN基因在百脈根中的表達則明顯受到接種根瘤菌的影響，在接種根瘤菌5h后NIN基因的表達量就會倍增。 7.利用基因槍轟擊使SIP1-紅色熒光(Ds-Red)融合蛋白導(dǎo)入洋蔥表皮細胞，瞬間表達結(jié)果顯示，SIP1蛋白的細胞中定位于細胞核。SymRK-PK和SIP1蛋白的相關(guān)激酶活性實驗表明，SIP1蛋白并不是Sy