海南尖峰嶺木本豆科植物根瘤菌資源研究.pdf

1、從海南尖峰嶺自然保護(hù)區(qū)24種木本豆科植物的根瘤中，分離了227株菌株，這些木本豆科植物中，蝶形花亞科9屬14種；蘇木科3屬3種；含羞草科5屬7種。本研究對(duì)具有根瘤菌菌落形態(tài)特性的117株根瘤菌進(jìn)行了16S rDNA鑒定，初步鑒定27株為根瘤菌，并進(jìn)一步研究了這27株根瘤菌的形態(tài)特征、生理生化特性、BIOLOG碳源利用、溶磷和解鉀特性；為了探討木本豆科植物根瘤菌對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力，本文對(duì)9株熱帶根瘤菌（Rhizobium tropici

2、）菌株的溫度生長(zhǎng)范圍、酸堿度耐受能力和耐鹽能力做了初步研究。研究結(jié)果如下：
　　16S rDNA序列分析結(jié)果表明：木本豆科植物根瘤菌具有遺傳的多樣性。將16S rDNA克隆序列與GenBank的序列比對(duì)分析后，做系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其中的27株與目前公認(rèn)的根瘤菌聚在一起：22株為熱帶根瘤菌（R.tropici）、1株為發(fā)根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes）、2株為墨西哥劍菌（Ensifer mexicanum）、2株為

3、β-變形桿菌綱的伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.）；其余的90株菌株與GenBank的已知序列比對(duì)后，初步鑒定為根瘤的內(nèi)生菌。27株根瘤菌的宿主不同，22株熱帶根瘤菌的宿主分別為長(zhǎng)眉紅豆、葫蘆茶、假地豆、野青樹(shù)、荔枝葉紅豆和馬占相思；1株發(fā)根根瘤菌分離自格木；2株墨西哥劍菌分離自墨西哥丁香；2株伯克霍爾德氏菌分離自藤黃檀。熱帶根瘤菌的菌株間16S rDNA的相似性也有差異：caf443與caf436的16S rDNA相似

4、度最低僅為98.8％，其他菌株間的相似度不同，但均在99.0%以上。
　　生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：其聚類(lèi)結(jié)果和16S rDNA序列聚類(lèi)結(jié)果基本吻合。表現(xiàn)為發(fā)根根瘤菌caf448與參比菌株發(fā)根根瘤菌、墨西哥劍菌caf249和caf254與同屬的費(fèi)氏中華根瘤菌、伯克霍爾德氏菌caf420和caf421與洋蔥伯克霍爾德氏菌分別聚在一起。22株熱帶根瘤菌與參比菌株熱帶根瘤菌、新疆中華根瘤菌聚為一群，但菌株間的生理生化特性有較大差異。

5、　　根瘤菌間碳源利用能力有差異，95種碳源中供試根瘤菌均可以利用有戊五糖、L-阿拉伯糖和α-D-葡萄糖，均不能利用的有α-環(huán)式糊精和肝糖。BIOLOG聚類(lèi)結(jié)果與生理生化的聚類(lèi)結(jié)果不同，表現(xiàn)為墨西哥劍菌caf249與熱帶根瘤菌聚為一群，而與同一屬的費(fèi)氏中華根瘤菌的聚類(lèi)較遠(yuǎn)。
　　溶磷的結(jié)果表明：尖峰嶺地區(qū)的根瘤菌具有較強(qiáng)的溶磷能力。24株根瘤菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶磷能力，均能溶解無(wú)機(jī)磷Ca3(PO4)2，所有菌株均不能溶解有機(jī)磷。在PKO

6、無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上caf446的D/d比值最大為2.037，D/d大于1.5的還有caf415(1.854)、caf437(1.570)、caf226(1.529)、caf276(1.880)、caf278(1.610)、caf334(1.678)、caf341(1.630)、caf344(1.596)、caf414(1.611)、caf420(1.543)和caf436(1.743)。磷鉬銻抗比色法測(cè)定D/d大于1.0的根瘤菌液體培養(yǎng)

7、基中全磷的含量發(fā)現(xiàn)：除caf438外其余的菌株的有效磷含量均高于對(duì)照（CK），caf341的有效磷含量最高為629.63mg/kg，caf436、caf276、caf444、caf278、caf336和caf344的含量均在400mg/kg以上。
　　解鉀的結(jié)果表明：根瘤菌的培養(yǎng)液中的可溶性鉀的含量顯著高于對(duì)照，caf224(1.617)、caf416(1.605)、caf420(1.498)、caf278(1.459)、caf4

8、40(1.466)、caf341(1.478)、caf344(1.497)、caf414(1.572)和caf415(1.532)可溶性鉀含量高于標(biāo)準(zhǔn)菌株CGMCC1.2540(1.445)。
　　綜合分析同時(shí)具有溶磷和解鉀能力的菌株有23株：caf224、caf225、caf226、caf414、caf415、caf416、caf341、caf344、caf333、caf334、caf336、caf276、caf278、caf2

9、79、caf437、caf438、caf439、caf440、caf443、caf444、caf446、caf436和caf420。其中溶磷解鉀能力均較強(qiáng)的有caf278、caf341、caf344、caf414、caf420。
　　熱帶根瘤菌的抗逆性研究發(fā)現(xiàn)：熱帶根瘤菌（R.tropici）的pH生長(zhǎng)范圍寬，均可耐受pH4-11，caf224和caf276耐酸能力更強(qiáng)可以耐受pH3；耐鹽能力強(qiáng)，均可以耐受2%的NaCl，caf2

10、26耐鹽能力更強(qiáng)可以耐受含4%NaCl的培養(yǎng)基；溫度適應(yīng)性強(qiáng)，所有菌株在20-37℃的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)良好，3株菌株caf224、caf414、caf336可以在10℃生長(zhǎng)，6株菌株caf224、caf226、caf414、caf415、caf438、caf276可以耐受45℃的高溫，而且供試菌株對(duì)短時(shí)間的高溫有耐受性，caf414、caf276可以耐受50℃20min高溫刺激，caf224、caf226、caf415、caf416、ca