產甲基丙二酰輔酶A假單胞菌的構建和雷帕霉素生物合成基因簇的定位.pdf

1、微生物次級代謝產物的研究與開發(fā)明顯受益于異源表達系統(tǒng)的應用,通過把來源于原始菌株的生物合成基因導入合適的新宿主菌株中,可以更容易地進行基因操作,研究沉默基因的功能和設計新的化合物,可以解決原始菌株難培養(yǎng)的問題以提高次級代謝物的產量,而且由于宿主菌比較清晰的代謝背景可以簡化次級代謝產物的提取工藝等。目前,微生物復雜次級代謝產物的多酶復合體基因異源表達方面研究最為深入的是聚酮類化合物。
　　 聚酮化合物成功地異源表達需要一個合適的宿

2、主菌,假單胞菌(Pseudomonas)由于生長快,可實現高密度發(fā)酵,G+C組成高,有成熟的遺傳操作系統(tǒng),有適合聚酮化合物異源表達的修飾系統(tǒng)等優(yōu)勢成為聚酮化合物異源表達的首選宿主之一。相當多的聚酮化合物的合成需要以甲基丙二酰輔酶A(methylmalonylCoA)作為延伸單位,而Pseudomonas本身不能產生mmCoA,因此本研究通過基因工程的方法構建能產生mmCoA的假單胞工程菌。在微生物中mmCoA可以通過兩條途徑合成,一個是

3、PCC途徑,由丙?；o酶A羧化酶催化丙酰基輔酶A生成;另一個是MCM途徑,琥珀酰輔酶A由甲基丙二酰輔酶A變位酶和差向異構酶催化生成。
　　 在本研究中利用兩種途徑來產生mmCoA,PCC途徑由來源于天藍色鏈霉菌(S.coelicolor A3(2))編碼丙?；o酶A羧化酶a亞單元的accA1基因和編碼丙?；o酶A羧化酶β亞單元羧基轉移酶的pccB基因組成;來源于惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT

4、2440)rpe和trpE基因片段作為同源重組片段;來源于pACYC177的kan基因(卡那霉素抗性基因),以上五個基因構建成順序為epi-kan-epi-mcm-argK-trpE的基因盒,將所構建的基因盒克隆到載體pEX100TlinK上構建成整合質粒,通過三親雜交的方法把基因盒整合到P.putida KT2440基因組中,得到雙交換子,命名為P.putida LS-PCC;MCM基因簇由來源于E.coli的編碼甲基丙二酰輔酶A變位

5、酶sbm基因,編碼甲基丙二酰輔酶A變位酶復合物保護蛋白的argK基因和源于S.coelicolor A3(2)的編碼差向異構酶的epi基因三個基因組成,用同樣的方法擴增kan基因和同源區(qū)域,共六個基因組成rpe-kan-epi-sbm-argK-trpE的基因盒,以同樣方法把MCM基因簇整合至P.putidaKT2440基因組中得到雙交換子命名為P.putida LS-MCM。
　　 氣相色譜和質譜連用分析表明P.putida

6、LS-PCC和P.putida LS-MCM均能產生mmCoA,產量分別達2.49 nmol/mL和2.22 nmol/mL。
　　 雷帕霉素(Rapamycin)是由吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)產生的31元大環(huán)內酯類聚酮化合物,具有免疫抑制作用,1999年正式作為免疫抑制劑藥物使用,除此之外它還具有抗真菌,抗腫瘤活性,最近的研究發(fā)現雷帕霉素具有延長小鼠、酵母、線蟲、果蠅壽命,還可一定的恢復患有阿爾茨海默類似癥狀

7、實驗小鼠的學習記憶能力,因此雷帕霉素及其類似物是一類具有藥用潛力的化合物。雷帕霉素原始生產菌株基因操作困難、產雷帕霉素能力低下、發(fā)酵周期長及高濃度產物和底物抑制等問題制約著雷帕霉素的研究開發(fā),因此異源表達雷帕霉素是很有必要的。S.hygroscopicus NRRL5491中雷帕霉素生物合成基因簇已經測序,基因簇為107.3 kb,其中聚酮合酶(PKS)基因約80 kb,包含3個大的開放閱讀框(rapA、rapB、rapC),在PKS基

8、因兩側有24個編碼框,主要編碼雷帕霉素后修飾和合成中一些關鍵步驟所需的酶。
　　 本實驗中,選擇合適的限制性內切酶酶切S.hygroscopicus NRRL5491的總基因組,利用脈沖場凝膠電泳分離酶切的片段,以特異性的rapP基因片段作為探針通過Southern雜交在凝膠上定位含有完整生物合成基因簇的片段,確定基因簇存在于兩個相距約360 kb的XbaI酶切位點之間。并設計了克隆雷帕霉素生物合成基因簇的Red/ET重組策略,