產(chǎn)甲基丙二酰輔酶A的假單孢菌菌株和德胺糖表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、聚酮化合物是一大類結(jié)構(gòu)多樣性的天然產(chǎn)物，并廣泛應(yīng)用于治療學(xué)，很多聚酮化合物需要以甲基丙二酰輔酶A(mm-CoA)作為整合C3單元的延伸單位。mm-CoA可以通過兩條途徑合成：PCC(丙?；鵆oA羧化酶)途徑，該途徑由兩個(gè)基因：accA1和pccB組成，accA1基因編碼丙?；o酶A羧化酶的α亞單元，pccB基因編碼羧基轉(zhuǎn)移酶亞單元；MCM途徑，MCM基因簇由三個(gè)開放閱讀框組成，即mm-CoA變位酶(MCM基因)、差向異構(gòu)酶(epi基因)

2、和ArgK共同完成。 用PCR的方法克隆MCM基因簇，從Escherichia coli(大腸桿菌)中擴(kuò)增mm-CoA變位酶基因和ArgK基因，從Streptomyces coelicolor A3(2)(天藍(lán)色鏈霉菌)中擴(kuò)增差向異構(gòu)酶基因；同時(shí)從Pseudomonas putida KT2440(惡臭假單胞菌)中擴(kuò)增兩段同源區(qū)域：left基因和right基因(1eft基因位于gph基因左側(cè)，包含rpe基因，長(zhǎng)度為1kb；rig

3、ht基因位于gph基因右側(cè)，是trpE基因的一部分，長(zhǎng)度為1.0kb);以pACYC177為模板擴(kuò)增卡那霉素抗性基因(Kan抗性基因)，長(zhǎng)度為1.0kb，以上六個(gè)基因，頹序?yàn)椋簂eft-kan-epi-mcm-argK-right，這樣MCM基因簇處于Kan抗性基因啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)，將所構(gòu)建的基因盒克隆到P.putida KT2440轉(zhuǎn)化載體pEX100TLinK。該載體含有蔗糖敏感型負(fù)篩選標(biāo)記SacB基因，當(dāng)含有MCM基因簇的質(zhì)粒通過結(jié)合

4、轉(zhuǎn)移的方法異源表達(dá)到P.putida KT2440，同源區(qū)域兩端發(fā)生雙交換，MCM基因簇被整合到P. putida KT2440基因組DNA，同時(shí)也有發(fā)生單交換的情況，單交換的菌株pEX100TLinK也被整合到P.putida KT2440基因組DNA中，由于SacB基因的存在，單交換的菌株不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此，結(jié)合轉(zhuǎn)移后轉(zhuǎn)化子經(jīng)蔗糖篩選后長(zhǎng)出的多數(shù)是雙交換的菌株。 PCC基因簇由兩個(gè)基因組成：accA1和pec

5、B。aeeA1基因和pecB基因都來源于S.coelicolor。用同樣的方法克隆抗性基因和同源區(qū)域，共五個(gè)基因，順序?yàn)椋簂eft-kan-aeeA1-pceB-right，克隆到p. putida KT2440中轉(zhuǎn)化載體pEX100TLinK，同樣方法篩選轉(zhuǎn)化子并驗(yàn)證。 MCM基因簇和PCC基因簇異源表達(dá)到P.putida KT2440中。對(duì)于已知基因簇異源表達(dá)可以選擇E.coil，S.lividans、P.putida、B.subt

6、ilis，很明顯每個(gè)系統(tǒng)都有其局限性，因此高效的表達(dá)一般都發(fā)生在與基因簇相近的微生物。放線菌及相關(guān)的鏈霉菌是被應(yīng)用最廣泛的異源表達(dá)體系，因?yàn)樗鼈兡芴峁┚弁衔锷锖铣扇康难b置，而且多數(shù)已知的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇都源自該屬。大腸桿菌也是頗受歡迎的異源表達(dá)體系，因?yàn)樗悄壳斑z傳學(xué)上的工具、有成熟的發(fā)酵方面知識(shí)、易于操作，但是它也有很多缺點(diǎn)，如與多數(shù)生物合成基因簇比有不同的G+C含量。在放線菌和E.coli間的差距可以由P.puti

7、da來彌補(bǔ)，P.putida產(chǎn)生的PKS/NRPS雜環(huán)分子是天然產(chǎn)生的五倍，發(fā)酵時(shí)間卻縮短了三倍。P.putida擁有E.coli的優(yōu)勢(shì)，如易于操作、遺傳學(xué)工其、可比的生長(zhǎng)率；也有放線菌的特性，像高的G+C含量、能產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物。 MCM基因簇和PCC基因簇異源表達(dá)的重組菌株通過GC/MC的方法進(jìn)行分析。甲基丙二酸鹽及其CoA酯和丁醇反應(yīng)后生成甲基丙二酸的二丁基酯(mmdiBE)，mmdiBE通過GC/MS定量分析。

8、　　格爾德霉素(Geldanamyein，GA)是一種苯醌安莎類抗生素，它和ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合熱休克蛋白Hsp90的ATP結(jié)合位點(diǎn)，影響Hsp90的功能。從藥效角度來看，在幾種入類癌癥中，Hsp90介導(dǎo)的蛋自在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄中有重要作用，這種治療靶點(diǎn)還沒有被運(yùn)用。因此引起人們研究GA的極大地興趣，并將GA及其類似物列為潛在的抗癌藥物。但其具有較強(qiáng)的肝毒性，而且水溶性也不好，在有機(jī)溶劑溶解狀態(tài)下穩(wěn)定性差，且見光易分解，對(duì)熱、酸、堿均不穩(wěn)定，所

9、以需要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)改造，尋找毒性和活性更好的衍生物。 對(duì)GA的結(jié)構(gòu)改造主要通過生物學(xué)方法和化學(xué)方法，通過生物學(xué)方法改造化合物的結(jié)構(gòu)，尤其特殊的優(yōu)勢(shì)；首先，通過生物學(xué)方法可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)難以進(jìn)行的反應(yīng)；其次，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物多位點(diǎn)的改造，產(chǎn)生多種衍生物；最后，生物學(xué)方法獲得基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵、提取的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境的污染少。本文想以生物學(xué)方法對(duì)GA結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，通過引入糖(德胺糖)組分，將糖的基因和大環(huán)內(nèi)酯類化含物的表達(dá)相

10、偶聯(lián)，以期改造格爾德霉素的溶解性。 　德胺糖是一種重要的脫氧胺基糖，很多結(jié)構(gòu)相關(guān)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物都含有德胺糖，如紅霉素，苦霉素、酒霉素。本研究選用的德胺糖生物合成基因來源予S.venezuelae的des基因簇，其12kb的生物含成基因蔟是由六個(gè)結(jié)構(gòu)基因、一個(gè)調(diào)節(jié)基因和一個(gè)外排基因組成，即desⅧ-Ⅶ-Ⅵ-R-V-Ⅳ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ,可分為desⅧ-Ⅶ-Ⅵ-R和desV-Ⅳ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元。實(shí)驗(yàn)證明德胺糖可與數(shù)種非天然糖苷