CTC菌株的分類鑒定與S-層基因的表達載體構(gòu)建.pdf

1、本研究內(nèi)容包括兩個方面，一方面運用16S-23SrRNA間隔區(qū)序列比較的方法完成了CTC菌株的系統(tǒng)發(fā)育學分類，將CTC菌株鑒定為蠟狀芽胞桿菌；另一方面分別將木室克隆的編碼S-層蛋白的基因ctc1和ctc2單獨或聚合連接到穿梭質(zhì)粒載體pHT304上，可以用于功能分析。 本室分離的CTC菌株，按照現(xiàn)行的表型分類法被巴斯德研究所鑒定為蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種，血清型為H2。然而，隨后的研究中表明，CTC菌株雖然可以形成伴胞晶體，但形成的

2、晶體很不穩(wěn)定，而且，其晶體蛋白組成與普通的蘇云金芽胞桿菌不同，并不是由質(zhì)粒攜帶的cry系列的基因編碼，而是染色體上編碼S-層基因的產(chǎn)物，且伴胞晶體蛋白沒有檢測到對昆蟲的毒性。因此，我們對其真實的屬性和表型分類的可靠性產(chǎn)生了懷疑。運用目前國際系統(tǒng)發(fā)育分類學上的新熱點技術(shù)——16S-23SrRNA間隔區(qū)序列比較的方法，選擇了一定的菌株組合進行測序，從系統(tǒng)發(fā)育水平上找到CTC菌株的相對準確分類學地位。通過設(shè)計特異引物，PCR擴增出組合中7個候

3、選菌并將PCR產(chǎn)物克隆進載體然后進行測序，一方面比較7株菌間的序列差異，同時通過檢索核酸數(shù)據(jù)庫，收集了其它來源的序列進行聚類分析。其結(jié)果表明，CTC菌株16SrRNA-23SrRNA間隔區(qū)序列與蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種代表菌T02的序列同源性在參比菌中最低，明顯不屬于同一類型，與巴斯德研究所運用表型分類法的結(jié)果不一致。進一步利用23SrRNA的部分序列或編碼S層基因的序列進行聚類分析，CTC菌株以及T02菌株在分類的結(jié)果上同來自其它來源的

4、蘇云金芽胞桿菌并沒有完全歸為一處，而是介于蘇云金芽胞桿菌和蠟狀芽胞桿菌之間。因此，結(jié)合目前已經(jīng)證實該菌株伴胞晶體由S層基因編碼，且對昆蟲無毒性的特點，我們認為CTC菌株屬于蠟狀芽胞桿菌，而且其可能處于蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌之間，與伴胞晶體形成的過渡類型遙相呼應(yīng)，具有重要的研究價值。 S-層是位于原核細胞外殼最外層的一種表膜亞單位結(jié)構(gòu)，呈晶格狀排列，在原核細胞中分布廣泛。S-層是由完全相同的亞單位組裝成的單分子晶格點陣結(jié)構(gòu)，

5、它的二維晶格亞單位又是由單一的糖蛋白裝配而成，在結(jié)構(gòu)上有高度的規(guī)則性，代表了一種在進化中最簡單的生物膜的發(fā)生模型。但是人們在研究中發(fā)現(xiàn)S-層在實驗室適宜的生長環(huán)境中很容易丟失掉，而在自然界有競爭的環(huán)境下則不被丟失。就目前人們的研究結(jié)果來看，人們對S-層的統(tǒng)一認識中的一點就是它是存在于細胞的表面。而本實驗室卻發(fā)現(xiàn)了CTC菌的S-層與眾不同，不僅在其表層有S-層的存在，而且該菌的晶體完全是由S-層蛋白組成。也就是說，該菌中的S-層不僅以表膜

6、亞單位的結(jié)構(gòu)存在于細胞表面而且以晶體的形態(tài)存在于細胞內(nèi)，而在該菌中也已克隆到兩個S-層蛋白編碼基因，這兩個基因與炭疽芽胞桿菌中的兩個S-層基因有非常高的同源性，但是炭疽芽胞桿菌中的這兩個基因編碼的S-層蛋白卻是正常形態(tài)存在的。因此具有重要的研究價值，為了更好的研究CTC菌株中S層基因的表達和形成晶體的機制，本研究克服了實驗中所遇到的特殊困難，分別構(gòu)建了獨立或聚合的S層基因的穿梭載體，這些構(gòu)建的載體包括，僅含有ctc1基因，僅含有ctc2