極細鏈格孢菌激活蛋白PeaT1結構域分析與功能研究.pdf

1、PeaT1是一種從極細鏈格孢菌中分離純化的激活蛋白，具有促進植物生長、提高植物抗性的作用。為了闡明PeaT1多效機制是否取決于分子內部可能存在的功能域，本文分析了PeaT1的結構域，構建了PeaT1及其三個缺失突變體表達載體，分別誘導表達目的蛋白，以期分析PeaT1結構域對其生物學效應和蛋白特性的影響。主要研究結果如下： 1.peaT1及其缺失突變體表達載體的構建 通過提取極細鏈格孢菌的總RNA，反轉錄成cDNA，進而擴

2、增獲得了peaT1基因。利用生物信息學對PeaT1蛋白進行了初步分析，得知其有兩個結構域：NAC(49-108位AA)和UBA/TS-N(162-206位AA)。用PCR方法擴增了3個缺失基因片段：peaT1-△CD99、peaT1-△ND49和peaT1-△ND108，將這三個片段分別與pET-28a連接構建了三個缺失突變體的融合表達載體。 2.PeaT1及其三個缺失突變體蛋白的表達和純化 將peaT1和三個缺失基因片

3、段的表達載體轉入E.coliBL21(DE3)細胞，經(jīng)IPTG誘導進行表達，獲得了PeaT1及其缺失突變體蛋白。用蛋白純化系統(tǒng)(AKTAExplorer10.0)對表達蛋白進行His·Tag親和層析和脫鹽處理，通過生物質譜技術獲得了PeaT1的標準分子量為26.319kD，與理論蛋白的分子量26.259kD相符。 3.PeaT1及其突變體蛋白的功能比較與分析 三個缺失突變體與PeaT1蛋白一樣，對小麥生長和抗病性都有顯著

4、的促進作用，而各表達蛋白之間的生物活性沒有顯著差異。結合生物信息學分析和前人研究結果推測：PeaT1蛋白NAC保守區(qū)域的作用機理，可能是其充當分子伴侶的作用，促進蛋白的正確折疊，以及其通過OB結合域的方式與TBP等轉錄因子結合，通過轉錄共激發(fā)子的作用促進下游某些基因的轉錄來促進植物生長，提高抗性；UBA/TS-N保守區(qū)域，與翻譯延伸因子EF1B(EF-Ts)相似，可能更多的是擔當一種翻譯共激發(fā)子來誘導植株生長和增強植物抗逆。由此推測，P

5、eaT1的2個結構域可能具有獨立或類似的生物功能。 4.穩(wěn)定同位素標記技術研究 PeaT1及其突變體蛋白誘導日本晴蛋白的差異表達分別用15N和14N培養(yǎng)基培養(yǎng)日本晴幼苗，在相同的生長環(huán)境下，用PeaT1及其突變體蛋白處理15N標記的水稻(14N標記水稻作為對照)。通過質譜測定獲得了近百種上調表達的蛋白，確定了PeaT1和3個缺失基因片段編碼的蛋白均能引起水稻日本晴蛋白的差異表達。通過對33種差異蛋白的功能分析，得知它們與

6、植物葉綠體光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ和翻譯起始因子相關，為激活蛋白作用機理的研究提供了理論基礎。 5.PeaT1及其三個突變體蛋白的熱穩(wěn)定性分析 對表達的PeaT1和三個突變體蛋白的耐熱性進行了分析，結果顯示它們都具有很好的熱穩(wěn)定性。通過氨基酸組成特性、三級結構的作用力分析了蛋白的耐熱機制。分析顯示，PeaT1及其突變體蛋白的氨基酸組成具有如下共同特征：含有較多的帶電氨基酸形成鹽橋；含有較多疏水氨基酸形成強大的疏水作用力；含有較