小鼠乳腺原基中干細胞定位及其再生功能性乳腺.pdf

1、由于乳腺組織結(jié)構(gòu)及發(fā)育特點，其已經(jīng)成為發(fā)育相關研究的理想模型之一。在乳腺發(fā)生、發(fā)育以及不同時期的增殖、衰退過程中，始終貫穿著乳腺干細胞的白我更新、增殖分化。本試驗中乳腺原基中干細胞的定位、乳腺原基移植再生乳腺以及乳腺發(fā)生、發(fā)育機制研究可以為人類乳腺疾病治療、因疾病切除后的乳腺再生等臨床應用和對家畜乳腺改造以生產(chǎn)某種珍貴蛋白、提高家畜哺乳能力和產(chǎn)奶量等提供新的思路和技術(shù)支持。 乳腺干細胞及不同類型的細胞群在乳腺原基中的定位有助于

2、止常乳腺發(fā)育分子機制的闡明。本研究利用細胞超微結(jié)構(gòu)特點和干細胞及其他不同細胞類群的分子標記進行了這些細胞在原基中的定位。電鏡技術(shù)以顯示原基中不同部位不同類群細胞的超微結(jié)構(gòu)特點。利用帶熒光標記的抗細胞角蛋白抗體顯示乳腺原基的輪廓，以此為參照，進一步定位Sca-1、CD10、Muc-1和CD34陽性細胞在原基中的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sca-1陽性細胞定位于原基中近邊緣區(qū)域，而此區(qū)域細胞富集有淡染細胞，這些淡染細胞表現(xiàn)為核質(zhì)、胞質(zhì)淡染，細胞器稀少

3、，缺少粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無細胞極性。其他細胞類群分布在原基的中部(Muc-1)或頸部區(qū)域(CD34)，而CD10陽性細胞則散布于乳腺原基中。 乳腺原基移植可以挽救轉(zhuǎn)基因致死動物的乳腺，使其在受體脂肪墊中繼續(xù)發(fā)育，研究轉(zhuǎn)基因與乳腺發(fā)育之間的關系。本研究以轉(zhuǎn)抗人漢坦病毒抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型為試驗材料，將其乳腺原基移植于清除乳腺的野生型小鼠脂肪墊中，并利用PCR、RT-PCR、原位雜交、H.E.染色、WesternBlotting、免

4、疫組化等方法對再生乳腺進行系統(tǒng)檢測。試驗結(jié)果表明，乳腺原基移植再生率為44.4％(24/54)；再生乳腺中含有轉(zhuǎn)基因，并且在RNA水平和蛋白質(zhì)水平能夠表達轉(zhuǎn)基因；轉(zhuǎn)基因表達量和表達方式僅與供體乳腺原基，即轉(zhuǎn)基因在供體鼠基因組中的整合方式有關，而與移植受體鼠無關。進一步研究表明，乳腺原基移植可以再生能夠分泌重組單克隆抗體的乳腺組織，能夠重演乳腺發(fā)育的整個過程，是一個良好的乳腺發(fā)育研究的技術(shù)平臺。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在移植后6周和移植受體鼠分娩后2

5、-3天，再生乳腺組織大小比同時期正常乳腺組織較小(1.4：1.84；2.47：3.6cm2)，而比對照組脂肪墊大(1.14；1.88cm2)。這說明，在乳腺發(fā)育過程中，乳腺導管、腺泡與乳腺脂肪組織相互促進增殖，進而使乳腺組織體積增大。 為進一步闡明乳腺原基發(fā)育的機制，將E14.5天乳腺原基完整或撕碎后移植于免疫缺陷鼠背部皮下，并給受體鼠注射雌激素、孕激素和促乳素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，撕碎后乳腺原基的大部分細胞均能形成導管，但不能形成分叉

6、。而完整的乳腺原基僅能從沒有間葉細胞層的頸部延伸出一些導管。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，再生的導管呈ER、PR陽性，促乳素處理后，其內(nèi)壁細胞呈現(xiàn)β-casein陽性。另外，乳腺原基在體外超低黏附培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細胞能增殖形成集落。這說明，乳腺原基中富含乳腺干/祖細胞，這些細胞在脫離正常體內(nèi)環(huán)境的情況下仍具有形成導管的潛能，但沒有來自乳腺脂肪細胞的信號時，不能形成分叉。再生的導管內(nèi)壁細胞能表達β-酪蛋白，這說明乳腺的形態(tài)發(fā)育與其功能的獲得是兩個獨立