抗人肝癌干細(xì)胞功能性單抗的研究.pdf

1、肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。越來越多的研究表明，導(dǎo)致肝癌治療失敗及死亡率高的根本原因是肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥，而肝癌干細(xì)胞在肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥中發(fā)揮重要作用。因此，靶向肝癌干細(xì)胞治療肝癌有望降低其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥，提高療效，降低死亡率。本研究具體內(nèi)容與結(jié)果概括如下：
　　1、肝癌干細(xì)胞的鑒定
　　目的：探究人肝癌細(xì)胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中是否存在肝癌干細(xì)胞。
　　

2、方法：采用無血清懸浮培養(yǎng)法和PKH26染色法確定人肝癌細(xì)胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中存在肝癌干細(xì)胞。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中的干細(xì)胞標(biāo)志物。
　　結(jié)果：Bel7402-V13和MHCC97-L細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)均可成為球，成球率分別為55％和22%。該兩株細(xì)胞經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)11d后形成的細(xì)胞球體中存在單個PKH26陽性細(xì)胞。流式熒光結(jié)果顯示，在Bel7402-V13細(xì)胞中

3、ESA+細(xì)胞在sphere細(xì)胞中的比例為8.43%，較親本細(xì)胞的2.58%上升了3.4倍；在MHCC97-L細(xì)胞中CD90+細(xì)胞的比例為3.41%，而在sphere細(xì)胞中CD90+細(xì)胞比例約為10.3%，MHCC97-L細(xì)胞經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)后，CD90+細(xì)胞的比例提升了3.0倍。
　　結(jié)論：人肝癌細(xì)胞系Bel7402-V13和MHCC97-L中存在肝癌干細(xì)胞，其干細(xì)胞標(biāo)志物分別為ESA和CD90。
　　2、抗人肝癌干細(xì)胞單抗

4、的篩選與鑒定
　　目的：探討靶向肝癌干細(xì)胞單克隆抗體的生物學(xué)特征及其體內(nèi)外功能。
　　方法：采用流式熒光檢測單抗21A3識別的細(xì)胞在Bel7402-V13和MHCC97-L親本及sphere細(xì)胞中的比例。運(yùn)用雙色流式熒光和雙色細(xì)胞免疫熒光檢測單抗21A3識別的抗原與兩株細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物的共染情況。流式細(xì)胞術(shù)在Bel7402-V13 sphere細(xì)胞中分選出的21A3+、親本和21A3-細(xì)胞后，采用無血清懸浮培養(yǎng)法、Tran

5、swell實(shí)驗(yàn)、CCK8法及小鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)，分別檢測其成球能力、侵襲能力、耐藥能力及動物體內(nèi)致瘤能力。運(yùn)用與上述相同的實(shí)驗(yàn)方法分別檢測單抗21A3對Bel7402-V13和MHCC97-L sphere細(xì)胞自我更新能力、侵襲能力和耐藥能力的影響。裸鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)分析單抗21A3聯(lián)合順鉑對Bel7402-V13移植瘤生長的抑制作用。
　　結(jié)果：首先，在細(xì)胞系Bel7402-V13中，我們采用流式熒光檢測發(fā)現(xiàn)21A3+細(xì)胞在sphe

6、re細(xì)胞中較親本細(xì)胞升高了4倍，表明21A3識別的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征；采用雙色細(xì)胞免疫熒光和雙色流式熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單抗21A3識別的抗原分子能與肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物ESA共染，表明其可識別肝癌干細(xì)胞；將流式分選獲得21A3+細(xì)胞、親本細(xì)胞和21A3-細(xì)胞進(jìn)行成球、侵襲、耐藥和裸鼠體內(nèi)致瘤能力的分析，發(fā)現(xiàn)21A3+細(xì)胞比21A3-細(xì)胞具有更強(qiáng)的成球、侵襲、耐藥和體內(nèi)致瘤能力，證明單抗21A3是一株抗肝癌干細(xì)胞的單抗。體外功能研究結(jié)果

7、顯示，單抗21A3能顯著抑制肝癌干細(xì)胞的成球和侵襲能力，抑制率分別達(dá)到23.9%和50.8%，且能顯著降低細(xì)胞對順鉑的耐藥能力；單抗21A3靶向肝癌干細(xì)胞體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，停藥時，高、低劑量單抗對移植瘤的抑制率分別為71.5%、54.4%，化療藥的抑制率為83.5%，而抗體聯(lián)合化療藥對移植瘤的抑制率則達(dá)到了97%。
　　采用同樣的路線和方法，在另一株人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L中研究單抗21A3的體外功能。流式熒光和細(xì)胞免