抗MBL單抗1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及其機(jī)制.pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）作為人體天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體，近年來(lái)一直是天然免疫研究的熱點(diǎn)之一。MBL是由肝細(xì)胞分泌的膠原樣復(fù)合血漿蛋白，為C型凝集素家族成員[1]。成熟的MBL肽鏈自N端至C端依次為富含半胱氨酸(Cys)的N末端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，CLR)、α螺旋構(gòu)成的頸區(qū)和C端的糖識(shí)別域(carbohydrate recognitiondomai

2、n，CRD)[2]。MBL在機(jī)體天然免疫中有重要的抗感染作用，它利用CRD識(shí)別廣泛分布于多種病原體如細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等表面的糖蛋白或糖結(jié)構(gòu)，例如D-甘露聚糖、鹽藻糖、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰葡萄糖胺等。其CLR與甘露聚糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin associated serineprotease，MASP1、MASP2、MASP3)結(jié)合形成MBL-MASPs復(fù)合物，激活補(bǔ)體介導(dǎo)的凝集素途徑而

3、發(fā)揮調(diào)理功能;或者與吞噬細(xì)胞膠凝素受體(ClqR)結(jié)合，以不依賴于補(bǔ)體的方式啟動(dòng)調(diào)理吞噬[1]。此外，球形結(jié)構(gòu)的CRD與某些病毒（如流感病毒A）結(jié)合后可直接中和病毒活性[3,4]。血漿中的MBL是二至六聚體的混合物[5,6]，只有三聚體及以上的高聚體MBL才能有效識(shí)別病原體表面的糖結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活補(bǔ)體[7]。
　　 MBL在人血清中的含量很低，正常人平均含量為1mg/L。MBL亦是一種急性期反應(yīng)蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下（如外科手術(shù)、病原

4、體感染、腫瘤等），其血漿濃度可升高2～3倍。MBL缺損患者處于高度的感染風(fēng)險(xiǎn)之中，表現(xiàn)為多種病原體的反復(fù)急慢性感染，然而MBL水平過(guò)高，可能會(huì)通過(guò)凝集素途徑而過(guò)度活化補(bǔ)體，導(dǎo)致機(jī)體的炎癥性損傷[1,8,9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，高M(jìn)BL水平與缺血-再灌注損傷的炎癥反應(yīng)、糖尿病腎臟并發(fā)癥及原發(fā)性膽汁性淤積型肝硬化有關(guān)[10,11,12]。相反，MBL水平低下，其激活補(bǔ)體的能力相對(duì)下降，則降低了炎癥介質(zhì)對(duì)宿主細(xì)胞的損傷。此外，高水平MBL可能會(huì)促進(jìn)

5、吞噬細(xì)胞（如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）對(duì)胞內(nèi)寄生菌的攝取，如結(jié)核分枝桿菌和利什曼原蟲(chóng)等，增加了病原體入侵的機(jī)會(huì)[13]，因此正常水平的MBL對(duì)機(jī)體尤為重要。眾所周知，單核巨噬細(xì)胞在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，并參與特異性免疫應(yīng)答。正常情況下單核巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬異物、細(xì)菌、衰老和突變的細(xì)胞以及天然的免疫復(fù)合物維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)[14]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，富含MBL的人血清能促進(jìn)吞噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬功能[15,16]。
　　 鑒于上述MB

6、L的重要作用和商品化抗MBL抗體的昂貴價(jià)格，本科室制備了一系列抗MBL單克隆抗體，并從中篩選了一株功能性單抗1C8。有研究表明，MBL能增強(qiáng)補(bǔ)體的活化和促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬病原體，但是抗MBL單抗對(duì)單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道，故本課題組以單核巨噬細(xì)胞為切入點(diǎn)，初步探索1C8對(duì)單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及其作用機(jī)制。我們首先鑒定了抗MBL抗體1C8的純度和生物學(xué)活性，它能與本科室提取的天然有活性的MBL和商品MBL以劑量依賴

7、的形式結(jié)合，并初步探討了1C8對(duì)混合人血清刺激的單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及其作用機(jī)制。
　　 第一章抗MBL單克隆抗體1C8的純化和鑒定
　　 隨著對(duì)MBL研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其除了能識(shí)別并清除病原體之外，還有許多內(nèi)源性功能(endogenous function)，例如識(shí)別缺血-再灌注損傷中暴露的自身抗原、參與吞噬凋亡細(xì)胞、結(jié)合腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮MBL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等，但是抗MBL抗體有關(guān)的報(bào)道甚少。目前市場(chǎng)上已經(jīng)

8、有商品的抗MBL單克隆抗體，但是因?yàn)槠鋬r(jià)格昂貴，令人望而卻步，而且其針對(duì)的是真核表達(dá)的商品MBL，而不是天然純化的MBL。本課題組多年以來(lái)一直致力于天然MBL的純化和相關(guān)功能的研究，尤其是純化分離MBL的技術(shù)已經(jīng)成熟。鑒于此，本科室制備了以天然純化的MBL為抗原的單克隆抗體（1C8等）。本部分工作主要是鑒定1C8的純度和生物學(xué)活性。
　　 首先復(fù)蘇本科室已經(jīng)制備并保存在液氮的雜交瘤細(xì)胞株1C8，然后制備單克隆抗體腹水，經(jīng)辛酸-硫

9、酸銨沉淀法(CA-AS)純化腹水中的單克隆抗體，進(jìn)一步我們分別運(yùn)用SDS-PAGE和Western-blot鑒定了1C8的純度與特異性，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbence assay，ELISA)同商品化的抗MBL抗體HYB131-11做了比較，檢測(cè)了1C8的敏感性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析，1C8不僅能與本科室自提天然有活性的MBL結(jié)合良好，亦能與商品MBL結(jié)合，而且同商品化的抗MBL抗體HYB1

10、31-11沒(méi)有顯著區(qū)別。以上結(jié)果表明1C8有良好的結(jié)合MBL的生物學(xué)活性，為1C8的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第二章1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響
　　 有研究表明，富含MBL的人血清能促進(jìn)吞噬細(xì)胞的調(diào)理吞噬和增強(qiáng)補(bǔ)體的活化，但是凝集素途徑過(guò)強(qiáng)則會(huì)導(dǎo)致炎癥性損傷。單核巨噬細(xì)胞作為專職的抗原遞呈細(xì)胞，它通過(guò)吞噬衰老的細(xì)胞和病原體等維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。本部分工作主要是分離和培養(yǎng)人單核巨噬細(xì)胞，旨在探討1C8對(duì)含MBL

11、的混合人血清誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響。
　　 無(wú)菌分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monoeuclear cell，PBMC)，用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析時(shí)，將1C8/IgG、10％滅活/未滅活混合人血清和FITC-白色念珠菌預(yù)先孵育30min后加入到PBMC中，37℃搖床孵育30min，然后檢測(cè)1C8對(duì)CD14+的單核細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌的影響。在用熒

12、光顯微鏡觀察1C8對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響時(shí)，預(yù)先將PBMC貼壁2h，待貼壁細(xì)胞形態(tài)良好時(shí)加入50ng/ml的M-CSF，培養(yǎng)9d。FCM結(jié)果顯示，1C8能抑制混合人血清誘導(dǎo)的單核細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌，而且能降低到無(wú)補(bǔ)體的滅活血清水平。在熒光顯微鏡下觀察1C8對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌的影響與FCM的結(jié)果一致，表現(xiàn)為1C8組的巨噬細(xì)胞吞噬FITC-白色念珠菌的數(shù)目減少。以上結(jié)果為1C8直接調(diào)節(jié)MBL介導(dǎo)的凝集素途徑提供了

13、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。尚需要進(jìn)一步解決的問(wèn)題是:1C8與MBL結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的初步確定;1C8對(duì)其他免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用等。
　　 第三章1C8對(duì)人單核巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的機(jī)制初探
　　 為了初步探討1C8對(duì)單核巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的作用機(jī)制，首先我們重組表達(dá)了人MBL-CRD蛋白(recombinant human MBL-CRD，rhMBL-CRD)，并對(duì)其進(jìn)行了SDS-PAGE和Western-blot鑒定。采用ELISA研究1C8與r

14、hMBL-CRD、MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白的結(jié)合，并用SDS-PAGE和Western-blot鑒定1C8與rhMBL-CRD、rhMBL-CLR結(jié)合的特異性。用直接ELISA分析甘露聚糖（mannan）、甘露糖(mannose)、D-半乳糖、D-半乳糖胺、D-甘露糖胺和D-葡萄糖胺對(duì)HRP-1C8結(jié)合rhMBL-CRD的影響。并用凝集實(shí)驗(yàn)觀察1C8對(duì)rhMBL-CRD結(jié)合FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠

15、菌的影響。rhMBL-CRD的Western-blot結(jié)果提示，rhMBL-CRD能與本科室制備的抗MBL-CRD單克隆抗體結(jié)合良好，在43KD處有明顯條帶。ELISA結(jié)果顯示1C8能以劑量依賴的方式結(jié)合rhMBL-CRD，但不與MASP-1C、MASP-2C和MASP-2N蛋白結(jié)合，同Western-blot的結(jié)果一致。直接ELISA的結(jié)果表明，1C8與rhMBL-CRD的結(jié)合能被上述六種糖所阻斷，隨著糖濃度的降低，1C8與rhMBL

16、-CRD的結(jié)合增強(qiáng)。在熒光顯微鏡下觀察FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌的凝集，發(fā)現(xiàn)1C8能阻斷FITC-大腸桿菌及FITC-白色念珠菌與rhMBL-CRD的結(jié)合，而作為1C8對(duì)照的IgG組則沒(méi)有區(qū)別。以上結(jié)果提示1C8通過(guò)CRD結(jié)合MBL，并通過(guò)與病原體表面的糖結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CRD而阻斷MBL介導(dǎo)的凝集素途徑。
　　 綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，抗MBL單克隆抗體1C8可與本科室自提天然有活性的MBL及商品MBL結(jié)合，而且與商品化的

17、抗MBL抗體HYB131-11沒(méi)有區(qū)別。通過(guò)檢測(cè)1C8對(duì)混合人血清刺激的單核巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬功能的影響及1C8與MBL結(jié)合部位的確定，初步獲得了1C8應(yīng)用價(jià)值的證據(jù)。但是1C8對(duì)MBL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)其它免疫細(xì)胞的影響均需要進(jìn)一步的研究。下一步工作將繼續(xù)探索1C8對(duì)單核巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和凋亡的影響，并進(jìn)一步研究1C8對(duì)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等的調(diào)節(jié)作用。本研究將為1C8的后續(xù)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為