仁術(shù)腸樂干預(yù)腸道菌群改善母嬰分離IBS大鼠腸道高敏感的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)作為一種功能性腸道疾病，一直缺乏明確的致病機(jī)制闡釋及長(zhǎng)期有效的治療藥物。中藥治療腸易激綜合征以調(diào)和肝脾為主，復(fù)方或單味藥起效機(jī)制的研究眾多，但對(duì)腸道菌群的干預(yù)作用研究目前較少。研究表明腸道菌群的改變與IBS發(fā)生與發(fā)展有著密切聯(lián)系，中藥復(fù)方通過(guò)口服與胃腸道中的腸道菌群直接接觸，因此對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用應(yīng)當(dāng)是中藥復(fù)方發(fā)揮治療作用的重要機(jī)制。本研究通過(guò)母

2、嬰分離方法建立腸易激綜合征腸道痛覺高敏大鼠模型，并用調(diào)和肝脾復(fù)方仁術(shù)腸樂(JCM-16021)進(jìn)行干預(yù)，利用PCR-DGGE、illumina測(cè)序技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)，研究該中藥復(fù)方對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)，菌群-宿主共代謝的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)觀察該復(fù)方對(duì)宿主腸道中識(shí)別微生物變化的toll樣受體通路及腸道屏障指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，從改善腸道菌群與宿主腸道功能狀態(tài)兩方面，探究該復(fù)方改善腸易激綜合征腸道痛覺高敏感癥狀的機(jī)制，豐富完善調(diào)和肝脾法方藥

3、的現(xiàn)代生物學(xué)闡釋。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一、母嬰分離模型腸道菌群及結(jié)腸組織toll樣受體改變實(shí)驗(yàn)研究
　　1.以母嬰分離模擬生命早期應(yīng)激，將出生后(postnatal Day，PD)14天、35天、56天）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組: PD14-NH、PD14-NMS、PD35-NH、PD35-NMS、PD56-NH、PD56-NMS，其中NH代表正常無(wú)處理大鼠，NMS代表母嬰分離大鼠;
　　2.收集出生后各時(shí)期各組大鼠糞

4、便樣本，利用PCR-DGGE技術(shù)觀察該模型各時(shí)期腸道菌群的改變;
　　3.收集出生后各時(shí)期各組大鼠結(jié)腸組織，從mRNA水平觀察該模型各時(shí)期大鼠結(jié)腸組織中識(shí)別微生物的重要分子toll樣受體（TLRs）表達(dá)的改變情況。
　　實(shí)驗(yàn)二、仁術(shù)腸樂干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究
　　1.建立母嬰分離IBS大鼠模型;通過(guò)結(jié)腸擴(kuò)張及腹壁撤退反射實(shí)驗(yàn)確立該模型有腹瀉型腸易激綜合征所具有的腸道痛覺高敏癥狀;
　　2.將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨分為正常對(duì)照組(NH組

5、)、母嬰分離模型組(NMS組)、高劑量中藥組(NMS+JCM-H組)、中劑量中藥組（NMS+JCM-M組）、低劑量中藥組(NMS+JCM-L組)、利福昔明組(NMS+Rifaximin組);
　　3.予藥物干預(yù)組仁術(shù)腸樂方（由炒白術(shù)、酒白芍、厚樸、炒薏苡仁、火炭母、煨訶子、醋延胡索等七味藥組成）或利福昔明灌胃兩周，仁術(shù)腸樂高、中、低劑量分別為2.42、1.21、0.605 g/kg/天，利福昔明劑量為150mg/kg/天;

6、　　4.取各組大鼠糞便，提取糞便菌群DNA，運(yùn)用illumina測(cè)序技術(shù)分析腸道菌群的具體改變，同時(shí)運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析糞便代謝產(chǎn)物的改變;
　　5.取各組大鼠近端結(jié)腸，運(yùn)用Western Blot法、免疫組化法等，從蛋白水平檢測(cè)與所改變的菌群類型及代謝產(chǎn)物種類最為的相關(guān)免疫指標(biāo)toll樣受體4(TLR4)、MyD88的表達(dá)情況，以及腸道屏障指標(biāo)ZO-1(zonula occluden-1)、occludin等表達(dá)情況。
　

7、　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一、母嬰分離模型腸道菌群及toll樣受體改變實(shí)驗(yàn)
　　1.PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)顯示，母嬰分離模型大鼠在幼年期及成年期均有不同于正常組大鼠的菌群結(jié)構(gòu)，其中出生后(Postnatal day, PD)14天(PD14)時(shí)兩組(PD14NH、PD14NMS)群落結(jié)構(gòu)相似度最低，說(shuō)明出生后14天模型組內(nèi)腸道菌群發(fā)生明顯變化。在PD14及PD56兩個(gè)時(shí)期，正常組較模型組細(xì)菌種類多，多樣性程度高;PD14NH組在各組樣

8、品中多樣性最高，PD35時(shí)兩組均呈現(xiàn)多樣性及豐度較低的趨勢(shì)，在PD56時(shí)兩組大鼠菌群多樣性有所上升，但均不如PD14時(shí)期;
　　2.各時(shí)期的正常對(duì)照組與模型組大鼠近、遠(yuǎn)端結(jié)腸TLRs的mRNA表達(dá)均有不同程度的差異，其中近端結(jié)腸的差異較遠(yuǎn)端結(jié)腸顯著，部分亞型在遠(yuǎn)端結(jié)腸的不同時(shí)期存在低表達(dá)的情況。
　　二、仁術(shù)腸樂干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究
　　1.腸道菌群改變結(jié)果
　　模型組大鼠菌群豐度(Species richness)較正

9、常組明顯降低，顯示其物種多樣性降低，運(yùn)用高、中、低劑量的仁術(shù)腸樂方干預(yù)及利福昔明干預(yù)后，各干預(yù)組大鼠的腸道菌群多樣性菌均顯著降低，其中以中藥高劑量組及利福昔明組最為明顯;模型大鼠具有不同于正常組大鼠的菌群類型，與其他劑量及陽(yáng)性西藥組相比，高劑量中藥復(fù)方組干預(yù)形成的腸道菌群與正常組最為接近;與正常大鼠相比，模型大鼠組菌群改變主要集中在放線菌門、擬桿菌門及硬壁菌門，表現(xiàn)為放線菌門、擬桿菌門增多而硬壁菌門減少。中藥及西藥干預(yù)均對(duì)各主要改變的菌

10、群影響顯著，高劑量仁術(shù)腸樂干預(yù)能顯著減少模型大鼠的糞便擬桿菌。
　　進(jìn)一步從分類學(xué)水平上總結(jié)各組大鼠成年期糞便菌群改變情況發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、紫單胞菌屬(Parabacteroides)、普里沃氏菌屬(Prevotella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭菌屬(Clostridium)、韋榮球菌屬(Veillonella)、Sutter

11、ella菌屬、Turicibacter菌屬、Akkermansia菌屬在母嬰分離大鼠中增高;而梭菌目(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachno spiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Phascolarctobacterium（韋榮球菌科）、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、螺桿菌科(Helicobacteraceae)等在母嬰大鼠中減少。
　　2.代謝產(chǎn)物改變結(jié)果

12、　　與正常大鼠相比較，母嬰分離大鼠糞便中測(cè)得的的代謝產(chǎn)物具有顯著不同的特征，主要集中在膽汁酸代謝、氨基酸代謝以及脂類代謝的過(guò)程中的代謝產(chǎn)物上。利福昔明及仁術(shù)腸樂對(duì)模型大鼠代謝產(chǎn)物的影響有所差別。
　　母嬰分離大鼠糞便中與疼痛相關(guān)的膽堿、組胺、花生四烯酸等物質(zhì)，L-谷氨酸等一系列氨基酸、糖類物質(zhì)、有機(jī)酸、飽和脂肪酸、膽汁酸等較正常組大鼠顯著增多;油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸等較正常組大鼠減少。
　　結(jié)論:
　　本研究通過(guò)在

13、菌群定植的關(guān)鍵時(shí)期（出生后兩周內(nèi)）給予母嬰分離應(yīng)激建立IBS腸道痛覺敏感動(dòng)物模型，以及給予母嬰分離模型大鼠中藥復(fù)方仁術(shù)腸樂及利福昔明干預(yù)治療后，明確以下結(jié)論:
　　1.母嬰分離大鼠在幼年期就已發(fā)生腸道菌群結(jié)構(gòu)的顯著改變，離乳前的菌群多樣性的減少，可能是成年后IBS發(fā)生的重要因素;
　　2.成年母嬰分離大鼠菌群結(jié)構(gòu)與糞便代謝譜顯著改變，主要表現(xiàn)為腸道菌群中擬桿菌門顯著增多，硬壁菌門顯著減少。菌群中與有機(jī)酸、膽汁酸代謝有關(guān)的細(xì)菌

14、含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。母嬰分離大鼠產(chǎn)糞便中糖類、蛋白質(zhì)、脂類代謝的過(guò)程中的代謝產(chǎn)物明顯改變，某些有機(jī)酸、膽汁酸、氨基酸、嘌呤類物質(zhì)、飽和脂肪酸增多，不飽和脂肪酸減少，可能與擬桿菌的增多使糖類及蛋白質(zhì)發(fā)酵作用過(guò)度、膽汁酸代謝與脂質(zhì)代謝異常有關(guān);
　　3.綜合菌群分析及糞便代謝產(chǎn)物分析結(jié)果，提示母嬰分離所導(dǎo)致的腸道痛覺高敏與革蘭陰性菌擬桿菌門、乳酸菌屬、梭菌屬等細(xì)菌，及與其相關(guān)的有機(jī)酸、膽汁酸、脂肪酸等代謝產(chǎn)物異常有關(guān)。雖然仁術(shù)腸樂

15、及利福昔明的干預(yù)都能夠造成NMS大鼠菌群和代謝產(chǎn)物的改變，但兩者干預(yù)改變的代謝產(chǎn)物有所不同，利福昔明主要明顯減少了糞便中膽堿、組胺、氨基酸、結(jié)合膽汁酸的含量。而仁術(shù)腸樂對(duì)宿主糞便代謝產(chǎn)物的影響更為廣泛，其中主要包括下調(diào)膽汁酸、氨基酸、花生四烯酸通路上某些代謝產(chǎn)物、多胺的含量及糖類、有機(jī)酸等，而上調(diào)不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸合成，甾體類激素合成等。腸道菌群及與其有關(guān)的代謝產(chǎn)物的改變，如有機(jī)酸、膽汁酸、膽堿、組胺、花生四烯酸代謝產(chǎn)物如前列腺

16、素等小分子物質(zhì)對(duì)激腸黏膜神經(jīng)末梢的化學(xué)刺激可能是造成腸道痛覺高敏的重要原因。
　　4.母嬰分離動(dòng)物模型結(jié)腸中各Toll樣受體(TLRs)亞型(TLR1～10)在出生后各時(shí)期與正常動(dòng)物相比均有顯著變化，TLRs通路的異常反映了宿主可能對(duì)腸道微生物及其代謝產(chǎn)物的改變具有高敏感性。
　　5.仁術(shù)腸樂復(fù)方治療腸道痛覺高敏癥狀的可能機(jī)制主要包括:(1)能夠從不同水平調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低擬桿菌門的數(shù)量，調(diào)節(jié)雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量及結(jié)