脫氧膽酸介導(dǎo)的腸道菌群失衡促進(jìn)腸腺瘤惡變的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腸癌是全世界最常見的腫瘤之一。抑癌基因腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli gene，Apc）突變是腸癌形成多步驟過程中的早期事件。高脂飲食在改變腸道菌群的同時(shí)增加腸腔內(nèi)脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）的含量，而DCA水平持續(xù)升高與腸癌發(fā)生顯著相關(guān)，然而腸道菌群與腸癌發(fā)生的因果關(guān)系尚未明確。本研究擬以腸腺瘤病小鼠模型Apcmin/+小鼠為研究對(duì)象，探討DCA促進(jìn)腺瘤

2、惡變過程中腸道菌群的改變，運(yùn)用菌群移植誘導(dǎo)腸腺瘤惡變并探索其機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分為探討DCA促進(jìn)Apcmin/+小鼠腺瘤惡變過程中腸道菌群改變，我們將4周齡野生型小鼠和 Apcmin/+小鼠分為三組：野生型組（含0.2％ DCA飲用水）、Apcmin/+對(duì)照組（常規(guī)飲食水）和Apcmin/+DCA組（簡稱DCA組）。實(shí)驗(yàn)0周和12周時(shí)收集新鮮糞便以行16S rRNA菌群檢測。顯微鏡下觀察并記錄腸道腺瘤的數(shù)目、大小

3、及分布情況。HE染色評(píng)估腸道腫瘤病理類型，免疫組化評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖情況，TUNEL技術(shù)評(píng)估腫瘤細(xì)胞凋亡。Realtime-PCR及免疫熒光評(píng)價(jià)腸道上皮緊密連接分子 mRNA和蛋白變化。實(shí)驗(yàn)12周時(shí)予 FITC-D以評(píng)價(jià)Apcmin/+小鼠腸上皮通透性。
　　第二部分為探討腸道菌群與腸癌發(fā)生的因果關(guān)系，將上述對(duì)照組和DCA組在實(shí)驗(yàn)12周后停止DCA干預(yù)（經(jīng)2周DCA洗脫期），作為糞便供體。處理糞便制成糞菌液后以灌胃方式予實(shí)驗(yàn)各組小鼠

4、（糞菌移植：FMT）：FMT1組（植入DCA組糞便的野生型小鼠）、FMT2組（植入對(duì)照組糞便的Apcmin/+小鼠）、FMT3組（植入DCA組糞便的Apcmin/+小鼠）。各組小鼠于FMT前予鏈霉素預(yù)處理3天，8周實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)共行FMT16次。收集實(shí)驗(yàn)8周時(shí)各組小鼠糞便檢測菌群變化。評(píng)估FMT后腸道腫瘤生長及細(xì)胞增殖情況。Realtime-PCR檢測FMT后腸粘膜炎性因子mRNA水平，同時(shí)檢測糞菌液刺激后結(jié)腸腫瘤細(xì)胞分泌的炎性因子mRNA

5、水平；并運(yùn)用免疫熒光雙染等方法評(píng)價(jià)FMT后腸道腫瘤微環(huán)境中單核-巨噬系統(tǒng)活化情況。免疫組化和 Western blot方法檢測 TLR4/MyD88和Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況。
　　第三部分為進(jìn)一步明確腸道菌群在腸癌發(fā)生中的重要作用，將4周齡Apcmin/+小鼠隨機(jī)分為兩組：DCA組和DCA聯(lián)合抗生素組（抗生素：0.2 g/L氨芐西林、0.1 g/L萬古霉素、0.2 g/L新霉素和0.2 g/L甲硝唑）。實(shí)驗(yàn)

6、12周時(shí)處死小鼠，于解剖顯微鏡和HE染色觀察腸道腺瘤生長及癌變情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　?。?）實(shí)驗(yàn)12周后野生型組小鼠腸道未出現(xiàn)腫瘤，且腸道組織結(jié)構(gòu)無明顯異常。對(duì)照組全腸道散在小腺瘤，多為管狀腺瘤，偶伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；DCA組腸道腺瘤總數(shù)明顯增多，以小腸中、遠(yuǎn)段及大腸腺瘤數(shù)目顯著；腸道腺瘤成簇密集出現(xiàn)，部分結(jié)腸近端有巨大腺瘤生長；遠(yuǎn)段小腸及70%結(jié)腸腺瘤為粘膜內(nèi)癌，余30%結(jié)腸腺瘤為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。同時(shí)

7、DCA使腸道腫瘤細(xì)胞增殖明顯增多，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著下降。
　?。?）DCA使腸道菌群多樣性明顯降低，并使厚壁菌門/擬桿菌門比例失衡。DCA加重腸道菌群失衡，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)12周較實(shí)驗(yàn)0周時(shí)腸道菌群構(gòu)成中致病菌如梭菌屬、脫硫弧菌屬、埃希-志賀菌屬等比例明顯增高，而益生菌如乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺旋菌等比例則降低。
　　（3）DCA使腸組織炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。
　　（4）DCA下調(diào)腸上皮緊密連接蛋白指標(biāo)ZO-1

8、及Claudin3基因表達(dá)水平；FITC-D示DCA使Apcmin/+小鼠腸上皮通透性顯著增加。
　　第二部分
　?。?）FMT1組腸道無腫瘤發(fā)生。FMT3組腸道腺瘤總數(shù)明顯增多，且72.7%（8/11）近段小腸腺瘤為粘膜內(nèi)癌；腫瘤細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。
　　（2）PCA分析顯示FMT2組與FMT3組腸道微生物群落在PC2與PC3維度上具有差異。實(shí)驗(yàn)12周時(shí) FMT3組厚壁菌門/擬桿菌門下降，腸道菌

9、群構(gòu)成中致病菌如埃希-志賀菌屬、副擬桿菌屬、脫硫弧菌屬、加式螺桿菌等明顯增多，而益生菌如乳酸桿菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺旋菌、柔嫩梭菌則明顯降低。
　　（3）DCA組糞菌液刺激IMCE和HT-29細(xì)胞系后，炎性細(xì)胞因子基因水平明顯上調(diào)。FMT3組腸組織炎性細(xì)胞因子、MCP-1及巨噬細(xì)胞F4/80顯著增多；且腫瘤間質(zhì)中M2型巨噬細(xì)胞表面分子比例增多，而M1型巨噬細(xì)胞表面分子比例減少。
　?。?）FMT3組腸道TLR4及M

10、yD88表達(dá)明顯上調(diào)、cadherin-E表達(dá)顯著減弱，β-catenin出現(xiàn)核異位表達(dá)，cyclin D1表達(dá)增多。
　　第三部分
　　從整體水平上調(diào)控腸道菌群可削弱 DCA誘導(dǎo)的 Apcmin/+小鼠腸道腫瘤進(jìn)展，表現(xiàn)為腫瘤數(shù)目減少、直徑更小、癌變率降低。
　　結(jié)論：
　　DCA介導(dǎo)的腸道微生態(tài)失衡可破壞腸粘膜屏障，誘導(dǎo)腸道低度炎癥發(fā)生，通過激活單核-巨噬系統(tǒng)，使巨噬細(xì)胞發(fā)生M1至M2型極化，進(jìn)而激活腫瘤相關(guān)