酵母Sls1p的表達(dá)、純化及抗體初步制備.pdf

1、線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞的能量代謝中心，線(xiàn)粒體基因組的不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體氧化磷酸化與ATP合成障礙，引起線(xiàn)粒體功能失調(diào)，進(jìn)一步影響細(xì)胞的能量代謝、自由基的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。
　　 SLS1(SigmaLikeSequence)位于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)第十二號(hào)染色體的421543到423474，系統(tǒng)名稱(chēng)為YLR139C，開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1932bp，編碼一個(gè)有643個(gè)氨基酸殘基的線(xiàn)粒體蛋白，相對(duì)分子

2、量為73.2kDa，等電點(diǎn)為10.02。研究報(bào)道Sls1p通過(guò)Nam1p協(xié)調(diào)mtDNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)敲除SLS1后導(dǎo)致酵母菌株在甘油培養(yǎng)基上生長(zhǎng)缺陷，線(xiàn)粒體氧化磷酸化活性和ATP產(chǎn)量顯著下降，8種mtDNA基因(COX1、COX2、COX3、ATP6、ATP9、CYTB、15SrRNA和21SrRNA)含量均顯著下降，且下降程度各不相同。SLS1恢復(fù)表達(dá)與過(guò)表達(dá)后，這8種mtDNA基因含量均有不同程度

3、增加。以上結(jié)果表明SLS1與mtDNA的穩(wěn)定性密切相關(guān)，可能與mtDNA直接作用或與其他線(xiàn)粒體擬核相關(guān)蛋白作用影響mtDNA穩(wěn)定性，但目前有關(guān)SLS1影響mtDNA穩(wěn)定性的機(jī)制尚不明確，Sls1p與其他線(xiàn)粒體擬核相關(guān)蛋白相互作用未見(jiàn)報(bào)道，并且沒(méi)有形成商品化的Sls1p抗體。本文將構(gòu)建Sls1p表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)、純化蛋白，制備單克隆抗體，為研究Sls1p相互作用蛋白及調(diào)控線(xiàn)粒體基因組穩(wěn)定性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 本文利用PCR技術(shù)體外

4、擴(kuò)增釀酒酵母SLS1，通過(guò)NotⅠ與SalⅠ酶切位點(diǎn)將其與質(zhì)粒載體pET28a連接，構(gòu)建pET28a重組質(zhì)粒（pET28a-SLS1）。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，得到可以啟動(dòng)T7promoter表達(dá)目的蛋白(Sls1p)的表達(dá)菌。通過(guò)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，得到表達(dá)菌的最佳誘導(dǎo)條件:37℃，0.4mmol/LIPTG誘導(dǎo)4h。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，Sls1p在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在，在細(xì)胞破碎后

5、的沉淀中，目的蛋白約為54％。包涵體蛋白經(jīng)8mol/L尿素溶解后，經(jīng)Ni+親和層析柱分離純化，透析脫鹽后的蛋白以絮狀沉淀形式析出，用2mLPBS重懸后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳膠密度面積掃描法測(cè)定蛋白濃度和純度，蛋白濃度達(dá)到2.5mg/mL，純度為88.3％。制備單克隆抗體，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)初步制備的抗體，目前已在免疫小鼠的血清中檢測(cè)到抗體，也已篩選出分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，但信號(hào)較弱，需進(jìn)一步篩選和制備?？贵w的制備將為研