青島文昌魚ERK5,p38抗體的制備及體內(nèi)蛋白表達(dá)的初步研究.pdf

1、ERK5、p38是MAPK家族中的重要成員，在生物體各項(xiàng)生命活動(dòng)具有重要的作用。MAPK家族成員是一類在細(xì)胞內(nèi)具有生物進(jìn)化的高度保守性，并可以被多種細(xì)胞外信號(hào)所激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs除參與了胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞死亡的過程外，還和腫瘤、炎癥等疾病有關(guān)，同時(shí)MAPKs也是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)獲得了文昌魚ERK5(Amphi-ERK5)、p38（Amphi-p38）基因序列。本

2、文利用生物信息學(xué)方法分析并選擇性克隆了部分抗原性較好的基因片段，插入載體制備蛋白表達(dá)載體，并利用表達(dá)的蛋白肽段誘導(dǎo)小鼠制備多克隆抗體;通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)成體文昌魚組織中的Amphi-ERK5、Amphi-p38蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè);與此同時(shí)，為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室制備的Amphi-ERK5、Amphi-p38抗體免疫組化結(jié)果的可信度，利用購買的ERK5、p38異源性抗體對(duì)成體文昌魚組織中的Amphi-ERK5、Amphi-p38蛋白表達(dá)

3、進(jìn)行了檢測(cè)。本研究為進(jìn)一步研究Amphi-ERK5、Amphi-p38蛋白的功能提供了一系列實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究構(gòu)建的Amphi-ERK5、Amphi-p38表達(dá)載體，是利用pet-29b(+)為表達(dá)載體，BL21(DE3)為表達(dá)菌株，通過原核表達(dá)的方法獲得目的蛋白。
　　 鼠抗文昌魚多克隆抗體的制備分別以兩種方法:
　　 1)制備Amphi-ERK5抗體，采用切膠純化后的文昌魚ERK5原核表達(dá)蛋白肽段為免疫

4、原，免疫小鼠，利用Amphi-ERK5原核表達(dá)蛋白肽段做Western blotting，檢測(cè)證明多克隆抗體制備成功后，獲取抗血清。
　　 2)制備Amphi-p38抗體，采用過柱純化并經(jīng)透析復(fù)性的文昌魚p38原核表達(dá)蛋白肽段為免疫原，免疫小鼠，利用Amphi-p38原核表達(dá)蛋白肽段做Western blotting，檢測(cè)證明多克隆抗體制備成功后，獲取抗血清。
　　 利用自制的Amphi-ERK5抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)

5、發(fā)現(xiàn)，Amphi-ERK5在成體文昌魚的表皮、腸、生殖腺、肝盲囊、咽鰓區(qū)有強(qiáng)烈的表達(dá)信號(hào)，而在脊索、肌肉中未見表達(dá)信號(hào)。利用羊抗人ERK5抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，也出現(xiàn)相一致的結(jié)果。利用自制的Amphi-p38抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Amphi-p38在成體文昌魚的表皮、腸、生殖腺、肝盲囊、咽鰓區(qū)均有強(qiáng)烈的表達(dá)信號(hào)，在肌肉中有較弱的表達(dá)信號(hào)，在脊索中未見表達(dá)信號(hào)。利用鼠抗人p38抗體對(duì)文昌魚組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，顯示組織中p38蛋白表達(dá)