利用人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫(kù)篩選凋亡相關(guān)siRNA.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)是雙鏈RNA分子引發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。該現(xiàn)象廣泛存在于多物種中。RNA干擾所致的同源基因降解現(xiàn)象引起生物學(xué)家的廣泛關(guān)注并將其改造成一種人為的基因阻斷技術(shù)，用于基因功能的研究。由于長(zhǎng)雙鏈RNA分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞能引起非特異性的干擾素反應(yīng)，RNAi技術(shù)的應(yīng)用最初局限于線蟲、果蠅等低等生物。隨著siRNA(small interfering RNA)特異性抑制作用的發(fā)現(xiàn)，R

2、NAi技術(shù)的應(yīng)用范圍延伸到哺乳動(dòng)物；并且從對(duì)單一、特定基因的研究迅速推及全基因組水平的功能研究，以此為契機(jī)推動(dòng)了siRNA文庫(kù)的構(gòu)建和使用siRNA文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選。 凋亡又叫做程序性細(xì)胞死亡。凋亡有其特有的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和生化機(jī)制。凋亡對(duì)于各種生命過程非常重要，如正常的細(xì)胞更新、發(fā)育和免疫反應(yīng)，激素依賴性組織萎縮，胚胎發(fā)育和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)凋亡等。凋亡失常與許多人類疾病有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、缺血損傷、自身免疫和腫瘤等。調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡

3、對(duì)于治療這些疾病非常重要。因此，很多研究致力于分析闡明細(xì)胞凋亡的機(jī)制和信號(hào)通路。 我們利用人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫(kù)在Jurkat細(xì)胞中篩選凋亡相關(guān)siRNA。siRNA文庫(kù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后使用rhTRAIL誘導(dǎo)凋亡。由于siRNA作用，那些具有抗凋亡特性的細(xì)胞將會(huì)存活、增殖，其他細(xì)胞將會(huì)被篩除。最終，那些具有抗凋亡特性的細(xì)胞在細(xì)胞群中得以富集。經(jīng)過3輪篩選，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫(kù)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NC的陰性對(duì)照組細(xì)胞

4、具有顯著增強(qiáng)的抗凋亡能力。隨后通過PCR--克隆--測(cè)序的方法獲知這些陽(yáng)性細(xì)胞中所轉(zhuǎn)染的siRNA表達(dá)片段序列。然后這些siRNA表達(dá)片段的抗凋亡作用被逐個(gè)驗(yàn)證。其中部分siRNA表達(dá)片段在Jurkat細(xì)胞中表現(xiàn)出明確的抗細(xì)胞凋亡作用。 綜上所述，我們建立了基于細(xì)胞功能表型的高通量siRNA文庫(kù)篩選方法；用人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫(kù)成功地進(jìn)行了大規(guī)模篩選，獲得了多個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的siRNA序列。為發(fā)現(xiàn)新的凋亡相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。