組織因子siRNA納米粒抑制靜脈移植物內(nèi)膜增生.pdf

1、第一部分、化學(xué)合成siRNA抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞TF基因表達(dá)。 目的：探討siRNA對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞組織因子基因沉默作用的可行性和有效性。 方法：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)大鼠組織因子的25bp雙鏈siRNA分子。使用組織因子siRNA、對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。PDGF-BB刺激血管平滑肌細(xì)胞后RT-PCR檢測(cè)組織因子mRNA表達(dá)，免疫印跡和免疫組化檢測(cè)組織因子蛋白表達(dá)

2、。 結(jié)果：siRNA成功轉(zhuǎn)染到血管平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率約90±2.3％。三對(duì)候選siRNA篩選出基因抑制效率最高一對(duì)，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染24h組織因子mRNA 表達(dá)減少86±0.6％，轉(zhuǎn)染48h組織因子蛋白表達(dá)減少92±1.0％，同時(shí)免疫組化檢測(cè)TF 表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論：RNA干擾能明顯下調(diào)大鼠血管平滑肌細(xì)胞組織因子表達(dá)。 第二部分、組織因子siRNA殼聚糖納米粒的制備及其特性。 目的：探討殼聚糖-組

3、織因子小干擾RNA(TFsiRNA)納米粒制備方法及其特征，并觀察體外基因沉默作用。 方法：采用三聚磷酸鈉(TPP)離子膠凝法制備殼聚糖-siRNA納米粒。檢測(cè)納米粒平均粒徑和zeta電位、載藥率、體外控釋效果，并分析血清穩(wěn)定性、體外生物活性及其細(xì)胞毒性。 結(jié)果：兩種納米粒平均粒徑小于400nm，粒徑大小主要取決于殼聚糖分子量及其濃度。殼聚糖與TPP質(zhì)量比、酸堿度也影響粒徑大小。包封型納米粒siRNA 載藥率為100％。

4、高分子量殼聚糖納米?？蒯屝Ч?。殼聚糖-TPP-TFsiRNA納米粒中的siRNA在5％血清孵育24h開(kāi)始降解，60h完全降解；50％血清孵育6h保持完整，48h完全降解。CS-TPP-TFsiRNA納米?；虺聊饔每膳cLipofectamine2000 相比：包封型79±1.5％,吸附型62±5.9％。 結(jié)論：殼聚糖納米粒是一種安全有效siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體。 第三部分、大鼠靜脈移植物組織因子表達(dá)及其意義。 目的

5、：檢測(cè)靜脈移植物管壁組織因子表達(dá)變化及其意義。 方法：建立SD大鼠同側(cè)頸外靜脈－頸總動(dòng)脈移植模型，分別于術(shù)后1、3、7、14、28天取材。對(duì)側(cè)頸外靜脈作為對(duì)照。免疫組化觀察管壁組織因子、增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本蛋白抽提物組織因子凝血活性。使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析內(nèi)膜、中膜厚度。 結(jié)果：所有移植物血管外膜均有組織因子表達(dá)，早期移植物（術(shù)后1、3、7天）內(nèi)膜、中膜組織因子表達(dá)明顯增加，晚期移植物（術(shù)后14、28天）

6、內(nèi)膜、中膜無(wú)組織因子表達(dá)；對(duì)側(cè)對(duì)照靜脈內(nèi)膜、中膜無(wú)組織因子表達(dá)。術(shù)后3天可以觀察到PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)，7天明顯增高，14天達(dá)到最高。對(duì)照組靜脈、早期和晚期靜脈移植物血管蛋白抽提物TF活性分別為0.28±0.02、0.29±0.04、0.28±0.04(U/mg)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。移植物內(nèi)膜在術(shù)后7、14、28天增生明顯，而中膜在術(shù)后14、28天增生明顯。 結(jié)論：不同時(shí)間點(diǎn)靜脈移植物管壁組織因子表達(dá)發(fā)生變化并與

7、新內(nèi)膜增生相關(guān)。 第四部分：Atelocollagen介導(dǎo)siRNA局部作用抑制大鼠靜脈移植物內(nèi)膜增生。 目的：評(píng)價(jià)局部應(yīng)用組織因子siRNA抑制靜脈移植物內(nèi)膜增生效果。 方法：建立SD大鼠頸靜脈-頸總動(dòng)脈移植模型。使用Atelocollagen-siRNA 混合物涂抹于靜脈移植物周?chē)?，檢測(cè)管壁BLOCK-iTTM 熒光寡核苷酸確認(rèn)其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。免疫印跡和免疫組化檢測(cè)管壁TF蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)管壁細(xì)胞增殖指

8、數(shù)，計(jì)算術(shù)后28天新生內(nèi)膜厚度。 結(jié)果：靜脈移植物可觀察到BLOCK-iTTM綠色熒光并持續(xù)到術(shù)后7天。治療組使用Atelocollagen攜帶siRNA有效抑制管壁TF蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖指數(shù)減少，術(shù)后28天新生內(nèi)膜厚度減少68±3.2％。 結(jié)論：非病毒載體Atelocollagen攜帶siRNA有效下調(diào)靜脈移植物TF表達(dá)抑制內(nèi)膜增生，這為靜脈移植物狹窄基因治療提供新的有效工具。 第五部分：靜電紡絲血管外支架緩釋

9、siRNA納米粒抑制靜脈移植物內(nèi)膜增生。 目的：評(píng)價(jià)PLGA/CS納米粒雜化超細(xì)纖維膜血管外支架緩釋組織因子小干擾RNA抑制靜脈移植物內(nèi)膜增生的有效性。 方法：使用改進(jìn)靜電紡絲技術(shù)制備PLGA/CS納米粒雜化超細(xì)纖維膜。氯仿溶解雜化膜PLGA后測(cè)量殼聚糖含量，檢測(cè)超細(xì)纖維膜吸水率。建立SD大鼠右頸外靜脈-頸總動(dòng)脈間置移植模型，隨機(jī)分為5組：A組（PLGA/CS-TFsiRNA納米粒外支架組），B組（PLGA/CS-Ste

10、althTM RNAi陰性對(duì)照納米粒外支架組），C組（PLGA/CS空白納米粒外支架組），D組（PLGA外支架組），E組（無(wú)外支架組）。BLOCK-iTTM熒光寡核苷酸檢測(cè)靜脈移植物轉(zhuǎn)染。分別于術(shù)后1，3，7，14，28天取標(biāo)本。免疫印跡和免疫組化檢測(cè)管壁組織因子蛋白表達(dá)，免疫組化檢測(cè)管壁增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)，計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)分析新生內(nèi)膜厚度。 結(jié)果：通過(guò)調(diào)節(jié)靜電紡絲PLGA和殼聚糖納米粒溶液流量控制雜化膜中PLGA和殼聚糖含量。雜

11、化膜由于加入殼聚糖具有良好吸水性。術(shù)后12天靜脈移植物管壁可檢測(cè)BLOCK-iTTM熒光寡核苷酸綠色熒光。術(shù)后3、7天A組組織因子蛋白表達(dá)明顯低于其他組(P＜0.05)，術(shù)后14天A組增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)明顯低于其他組(P＜0.01)，A組術(shù)后28天新生內(nèi)膜厚度明顯低于未治療組(P＜0.01)。 結(jié)論：靜電紡絲制備PLGA/CS納米粒雜化超細(xì)纖維膜血管外支架緩釋組織因子siRNA能有效抑制大鼠靜脈移植物早期內(nèi)膜增生，這將成為基因治