焦磷酸測序技術(shù)檢測短片段牙釉質(zhì)蛋白基因進行性別鑒定的研究.pdf

1、目的：性別信息是法醫(yī)檢案過程中及考古研究過程中最重要的信息之一。通常在尸表保存完整的情況下，法醫(yī)工作者可以通過形態(tài)學(xué)分析做出判定。然而面對重大群體性災(zāi)難事件中人的骨架完整性被破壞，或者由于小孩骨骼發(fā)育不全導(dǎo)致形態(tài)學(xué)分析難以得出鑒定結(jié)論時，分子水平的鑒定方法就顯得尤為重要了。目前，常用的進行性別鑒定的DNA技術(shù)主要包括，Y染色體的特異性探針、鋅指蛋白(ZFY/ZFX)基因和牙釉質(zhì)蛋白基因(Amelogenin gene，AMEL)的檢測，

2、其中對牙釉質(zhì)蛋白基因的檢測應(yīng)用得最為廣泛。自1991年，Nakahori等人對牙釉質(zhì)蛋白基因進行測序后，Nakahori(1991)、Akane(1991)、Bailey(1992)、Sullivan(1993)先后用PCR擴增單拷貝X、Y同源區(qū)域進行性別測定。目前Sullivan法應(yīng)用得最廣泛，在多個法醫(yī)個人識別試劑盒中做為性別鑒定的方法，其擴增片段為106bp和112bp。然而，對于一些高度腐敗降解的生物檢材，以及由于AMEL序列突

3、變及性染色體變異造成的“無效擴增”，現(xiàn)有的檢測技術(shù)往往不能獲得明確的分型結(jié)果。針對這一問題，本研究建立了一種新的性別DNA分析方法，即應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)分析牙釉質(zhì)蛋白基因45bp的DNA片段，并對該方法的靈敏度，種屬特異性，降解模型，骨骼樣本等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進行初步研究，以期為一些疑難案件的性別鑒定提供參考。
　　 方法：⑴ 根據(jù)Genebank上提供的AMELX和AMELY的核苷酸序列通過Blast進行比對后，選擇一段含有3個單核

4、苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點及1個插入/缺失位點的序列作為待測靶序列。用Primer5和Oligo6等引物設(shè)計軟件設(shè)計擴增引物和測序引物，一條擴增引物標(biāo)記生物素；利用焦磷酸測序軟件建立預(yù)期模型；對反應(yīng)體系中的引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等條件進行優(yōu)化，選擇最佳反應(yīng)條件進行PCR擴增，應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)對PCR產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果判定性別。應(yīng)用該方法對100份已

5、知性別(男女各50份)的中國漢族健康無關(guān)個體進行測序分析，驗證本方法的可靠性和準(zhǔn)確性。⑵ 選取男女兩份 DNA樣本，定量后稀釋為1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng和0.0625ng進行靈敏度檢測；應(yīng)用本方法對猴、狗、兔、豬、牛、魚、雞的DNA樣本以及大腸桿菌、腸球菌、念珠菌的菌株進行分析，驗證其種屬特異性；將新鮮血液放置于6月-11月的自然環(huán)境中26周模擬高度降解檢材，用Dnase I制備人工降解DNA，應(yīng)用本研究構(gòu)建的方

6、法及商品化AmpF/STR IdentifilerTM試劑盒分別對其進行性別分析，比較二者的成功率；提取骨骼樣本DNA，應(yīng)用本方法對骨骼DNA進行分析。
　　 結(jié)果：⑴ 成功構(gòu)建了應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)檢測短片段牙釉質(zhì)蛋白基因進行性別鑒定的方法。本方法的擴增片段包含上下游引物在內(nèi)只有45bp，同時包含了多個點突變和插入缺失突變。焦磷酸測序圖清晰、直觀、容易判型。應(yīng)用本方法對100份已知性別個體DNA的檢測分析顯示，所有樣本均能得到清

7、晰的分型結(jié)果，與預(yù)期模型無異，分型結(jié)果準(zhǔn)確。⑵法醫(yī)應(yīng)用評估：① 本方法能夠正確分型的最低DNA模板量為1ng，具有較高的靈敏度；②在檢測的所有動物及菌株中，應(yīng)用本方法進行分析，除在恒河猴檢出產(chǎn)物峰外，其余常見動物和微生物均未檢測到特異性產(chǎn)物峰，具有較好的人類種屬特異性；③ 對8份降解26周的血液檢材進行分析，本方法均得到了清晰正確的分型結(jié)果，而應(yīng)用IdentifilerTM試劑盒檢測，6份樣本分型明確，2份樣本分型失敗；④ 對Dnase

8、 I 制備的降解DNA進行分析，本方法對Dnase I 消化5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min的DNA均能正確分型，測序結(jié)果非常清晰，而IdentifilerTM試劑盒僅能對Dnase I 消化5min、10min的DNA進行正確分型，且牙釉質(zhì)蛋白基因產(chǎn)物峰的相對熒光單位(Rfu)較低，對消化15min及更長時間的DNA均未得到產(chǎn)物峰，分型失?。虎?對6份來自4種不同部位的骨骼進行DNA的提

9、取和分析，除牙齒由于取材量少導(dǎo)致分型失敗外，其余5份骨骼DNA均得到清晰的分型結(jié)果。
　　 結(jié)論：本研究建立了一種應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)檢測牙釉質(zhì)蛋白基因進行性別鑒定的方法，擴增產(chǎn)物僅為45bp，操作簡單、快捷、通量高、成本較低；檢測的靶位點包括3個點突變位點和1個插入缺失位點，保證了良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；靈敏度達1ng，具有較好的人類種屬特異性；對高度降解檢材的檢驗成功率明顯高于常規(guī)方法。綜上，本方法對于高度降解檢材或古DNA的性