焦磷酸測序法檢測MEG3及GRAF基因在急性髓系白血病中的甲基化狀態(tài).pdf

1、研究背景：
　　DNA甲基化通過調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞生物學(xué)的行為，是表觀遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要方面。腫瘤細(xì)胞存在全基因組普遍低甲基化及局部(啟動(dòng)子CpG島)高甲基化，尤其是抑癌基因的高甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)的失活是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素。近年來也有許多關(guān)于急性髓系白血病的形成與表觀遺傳學(xué)的研究，尤其是與DNA甲基化之間關(guān)系的研究。對(duì)特殊基因的甲基化研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一種新的與疾病的診斷、治療相關(guān)的生物標(biāo)志物。焦磷酸測序技術(shù)是一種新的基

2、于DNA序列分析的技術(shù)，可以同時(shí)檢測多個(gè)甲基化位點(diǎn)，可以對(duì)甲基化程度進(jìn)行精確定量。目前國內(nèi)關(guān)于焦磷酸測序技術(shù)的報(bào)道較少。有研究指出MEG3基因及GRAF基因的異常甲基化可能與急性白血病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。我們旨在建立一種新的定量檢測方法——焦磷酸測序法檢測MEG3基因及GRAF基因在急性髓系白血病中的甲基化狀態(tài)，及其臨床意義。
　　第一部分：
　　焦磷酸測序法檢測MEG3基因在急性髓系白血病中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義
　　

3、目的：應(yīng)用焦磷酸測序法檢測 MEG3基因的啟動(dòng)子區(qū)在急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓細(xì)胞中的甲基化狀態(tài),并探討其在AML中的臨床意義。
　　方法：以54例初診AML患者骨髓細(xì)胞標(biāo)本為研究對(duì)象，11例缺鐵性貧血患者骨髓細(xì)胞標(biāo)本、10例健康人外周血標(biāo)本為對(duì)照。另收集10對(duì)AML患者治療前后骨髓細(xì)胞標(biāo)本為研究對(duì)象。常規(guī)提取DNA并用亞硫酸氫鹽處理。然后用PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，采用焦磷酸測序法檢測MEG3基因甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果：<

4、br>　　1.MEG3基因的高甲基化狀態(tài)與AML患者的年齡、性別、白細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白量、血小板計(jì)數(shù)等指標(biāo)及臨床分型間均未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。
　　2.AML患者低甲基化的例數(shù)為5，高甲基化的例數(shù)為49，高甲基化的比例為49/54(90.7％)；缺鐵性貧血患者對(duì)照組低甲基化的例數(shù)為6，高甲基化的例數(shù)為5，高甲基化的比例為5/11(45.5%)；而在正常人對(duì)照組低甲基化的例數(shù)為10，無高甲基化的例數(shù)，高甲基化的比例為0(0%)；AML患

5、者甲基化狀態(tài)明顯高于另外兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，缺鐵性貧血患者對(duì)照組與正常人對(duì)照組之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.AML患者治療前甲基化狀態(tài)高于治療后，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 MEG3基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化與急性髓系白血病的發(fā)生有關(guān)，對(duì)診斷、評(píng)價(jià)AML有一定意義。
　　第二部分：
　　焦磷酸測序法檢測GRAF基因在急性髓系白血病中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義
　　目的：應(yīng)用焦磷酸測序法檢測 GRAF基因的啟動(dòng)子區(qū)

6、在急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓細(xì)胞中的甲基化狀態(tài),并探討其在AML中的臨床意義。
　　方法：以60例初診AML患者骨髓細(xì)胞標(biāo)本為研究對(duì)象，10例缺鐵性貧血患者骨髓細(xì)胞標(biāo)本、10例健康人外周血標(biāo)本為對(duì)照。另收集10對(duì)AML患者治療前后骨髓細(xì)胞標(biāo)本為研究對(duì)象。常規(guī)提取DNA并用亞硫酸氫鹽處理。然后用PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，采用焦磷酸測序法檢測GRAF基因甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1.AML患者中無甲基化的例數(shù)為60，低

7、甲基化的例數(shù)為0，高甲基化的比例為0；缺鐵性貧血無甲基化的例數(shù)為10，低甲基化的例數(shù)為0，高甲基化的比例為0；正常人對(duì)照組無甲基化的例數(shù)為10，低甲基化的例數(shù)為0，高甲基化的比例為0；三組之間的甲基化狀態(tài)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.AML患者治療前后甲基化狀態(tài)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.GRAF基因可能通過其他機(jī)制而不是異常甲基化的方式導(dǎo)致急性髓系白血病的發(fā)生。
　　2.焦磷酸測序法作為DNA甲基化的