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文檔簡介
1、目的:應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)和T-A克隆測序檢測九種惡性血液病細(xì)胞株以及急性白血病患者SFRP基因的甲基化狀態(tài),篩選SFRP基因高甲基化的惡性血液病細(xì)胞株,并將其作為研究SFRP基因甲基化與表達(dá)關(guān)系的實驗對象;探討5-雜氮-2'脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)逆轉(zhuǎn)急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株SFRP基因甲基化狀態(tài)及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用
2、及其可能的機(jī)制,同時觀察SFRP基因甲基化狀態(tài)逆轉(zhuǎn)對Wnt信號途徑及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。
方法:采用MSP和T-A克隆測序檢測九種惡性血液病細(xì)胞株以及急性白血病患者SFRP基因的甲基化狀態(tài);采用CCK-8法檢測5-Aza-CdR對Jurkat細(xì)胞系存活率的影響;Hoechst-PI熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況,Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測凋亡率;MSP法檢測藥物作用前后SFRP基因甲基化狀態(tài)變化,熒光
3、實時定量PCR法檢測SFRP基因、RT-PCR檢測DNMT1、DNMT3A、DNMT3B以及β-catenin、survivin、c-myc、和cyclin-D1 mRNA的表達(dá);Western-blotting鑒定β-catenin蛋白的表達(dá)變化。
結(jié)果:(1)經(jīng)過MSP和T-A克隆測序鑒定,SFRP1、2、4、5基因啟動子區(qū)異常甲基化在九種惡性血液病細(xì)胞系中廣泛存在;87例AL患者中SFRP1、2、4、5甲基化總陽性率
4、分別是35.6%、25.3%、12.6%、17.2%。(2)5-Aza-CdR作用Jurkat細(xì)胞72h后SFRP基因甲基化程度明顯減弱,并且表達(dá)上調(diào),同時甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達(dá)下降并呈濃度依賴性。(3)5-Aza-CdR對Jurkat細(xì)胞生長有明顯的抑制作用,隨藥物濃度的增高,細(xì)胞凋亡比例也逐漸增加。(4)5-Aza-CdR作用Jurkat細(xì)胞72h后,Jurkat細(xì)胞中β-catenin表達(dá)明顯降低,
5、同時survivin、c-myc和cyclin-D1等表達(dá)也隨藥物濃度的增高而降低,與未加藥組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)論:(1)SFRP1、2、4、5基因啟動子區(qū)異常甲基化在惡性血液病細(xì)胞系中廣泛存在,在AL患者中,SFRP1、2、4、5基因已出現(xiàn)高頻率甲基化。(2)5-Aza-CdR在體外能夠逆轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞中SFRP基因的高甲基化狀態(tài),從而激活SFRP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。(3)5-Aza-CdR在體外逆轉(zhuǎn)Jurk
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