[教育]釉原蛋白基因性別鑒定

1、以釉原蛋白基因進(jìn)行性別鑒定,,實(shí)驗(yàn)九 以釉原蛋白基因進(jìn)行性別鑒定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 通過此實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)PCR檢測(cè)技術(shù)，包括DNA提取、分光光度計(jì)的使用、引 物設(shè)計(jì)的原則、PCR擴(kuò)增的條件設(shè)定，以及電泳和測(cè)序結(jié)果分析等。實(shí)驗(yàn)原理： 針對(duì)Amelogenin基因內(nèi)含子1區(qū)X染色體上6bp缺失的特性，采用一對(duì)X、 Y同源引物擴(kuò)增，男性個(gè)體同時(shí)得到X染色體Amelogenin等位基因特異

2、 性段(簡(jiǎn)稱Am X，106 bp或212 bp)和Y染色體Amelogenin等位基因特異 性片段(簡(jiǎn)稱Am Y，112bp或218 bp)，分型結(jié)果表現(xiàn)出兩條譜帶；而女 性僅有Am X(106 bp或212 bp)，分型表現(xiàn)為一條譜帶，因此鑒定性別。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：,5ml無菌試管（含肝素抗凝劑）；PowerPlex M16 system DNA提取試劑盒，Am

3、基因上游引物和下游引物，2×Taq PCR MasterMix；20bp DNA Ladder Marker；DNA片段快速純化試劑盒。PCR儀，凝膠成像儀，微量紫外分光光度計(jì)，電泳儀 。,實(shí)驗(yàn)方法：,樣品采集,采集靜脈血5ml于無菌抗凝管中,DNA 提取和含量檢測(cè),,,性別鑒定,PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳、純化測(cè)序,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),PCR的基本原理,試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體

4、外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。,PCR反應(yīng)體系,4種dNTP混合物 各200umol/L引物 　　　　 各10～100pmol模板DNA 　　　 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 　　　　　 1.5mmol/L,PCR的條件設(shè)定,,7

5、2℃,,94℃,55℃,,,,,,PCR循環(huán),PCR的條件設(shè)定,1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃，30～60s）,紫外分光光度計(jì),紫外分光光度計(jì)，就是根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜研究物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)間相互作用的有效手段。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子 、原子和不同的分

6、子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會(huì)相同，因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長(zhǎng)處的吸光度的高低判別或測(cè)定該物質(zhì)的含量。,凝膠電泳,凝膠電泳的原理比較簡(jiǎn)單。當(dāng)一種分子被放置 在電 場(chǎng)當(dāng) 中時(shí) , 它們 就會(huì) 以一定 的速 度移向適當(dāng)?shù)碾姌O 。這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度 , 叫做電泳的遷移率。它同電場(chǎng)的強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說 ,電場(chǎng)強(qiáng)度越大、電泳分子所攜帶的凈電

7、荷數(shù)量越多 ,其遷移的速度也就越快 , 反之則較慢。 遷移率不同，其最終分布于不同條帶。,實(shí)驗(yàn)方法：,DNA 提取和含量檢測(cè)：,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),實(shí)驗(yàn)方法：,性別鑒定——PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳、純化測(cè)序PCR 擴(kuò)增：PCR反應(yīng)引物序列如下：上游引物( 5‘- CCCTGG GCT CTG TAA AGA ATA GTG-3’)，下游引物( 5‘-ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG－3’)；

8、模板DNA為上述血液所獲樣品的DNA提取液。PCR 反應(yīng)體系為25μL，其中2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，上下游引物( 1μmol /L)各1μl，無菌雙蒸水9.5μl，模板DNA 1μl。PCR 反應(yīng)參數(shù): 95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。凝膠電泳：制備濃度為3g/L的瓊脂糖凝膠，置1×TAE電泳緩沖液中，電泳條件為:

9、 電壓100V，電泳時(shí)間120分鐘。電泳結(jié)果放入凝膠成像儀中進(jìn)行觀察。純化測(cè)序：將瓊脂糖凝膠上的特異性條帶切下純化、回收、測(cè)序。,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),注意事項(xiàng)：引物 引物是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，其特異性取決于引物與模板DNA的互補(bǔ)程度。引物的長(zhǎng)度最好為15bp～30bp；引物擴(kuò)增跨度以200bp～500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)度至10kb的片段；其中G+C含量以40%～60%為宜，ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌

10、呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)或兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)；3’端的堿基，尤其最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)；引物中有或最好加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)；引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性；每條引物的濃度0.1μmol～1μmol或10pmol～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。PCR 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增的程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于

11、模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30次～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，但非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。設(shè)立對(duì)照 PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要參考指標(biāo)。,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),結(jié)果分析：,M-marker；1、2-陰性對(duì)照；3、5-女性；4-男性,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),為什么要用冷蒸餾水，冰中放置5分鐘后，在4℃下離心？,提取過程中細(xì)胞

12、壁破碎細(xì)胞質(zhì)流出，中間有酶會(huì)降解流出的DNA ，因此要低溫保存來抑制酶的活性，防止DNA被降解 。,Triton X-100,100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑），它能溶解脂質(zhì)，提高真核細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性。其中1%的Triton X-100常用于漂洗組織標(biāo)本和破壞細(xì)胞。,SDS,十二烷基硫酸鈉SDS是一種能夠使蛋白質(zhì)變性的去污劑。它用于確定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。它也可以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)

13、胞壁及裂解核酸蛋白復(fù)合物。在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，使DNA釋放出來。,蛋白酶K,是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。在尿素或SDS中，蛋白酶K顯示更高的酶活性。蛋白酶K的最佳反應(yīng)溫度為65℃，但在65℃或更高的溫度蛋白酶K自身的也非常迅速地降解。很多時(shí)候反應(yīng)溫度選擇50-55℃。,6.0mol/Nacl的作用,DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用這一特點(diǎn)，選擇

14、適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。,為什么用無水乙醇沉淀DNA？,用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占

15、67％左右。,TE溶液,TE是由Tris（三羥甲基氨基甲烷）和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA。,Chelex-100,Chelex-100 是一種由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成的化學(xué)螯合樹脂，含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子，可螯合多價(jià)離子，特別是對(duì)高價(jià)金屬離子有很高的親和力和螯合作用，能有效除去非核酸有機(jī)物。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮沸的條件下，可以使細(xì)胞膜破裂，并使蛋白質(zhì)變性，通過離心除去Chelex顆粒，使其結(jié)合的

16、物質(zhì)與DNA 分離。,紫外分光光度計(jì)測(cè)試樣品在260nm的OD值,光通過被檢測(cè)物，前后的能量差異即是被檢測(cè)物吸收掉的能量，特定波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。檢測(cè)單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度.通過DNA的OD260（260nm下的吸光值） 可以知道DNA的濃度   具體換算是DNA濃度（ug/ml）=OD260*50*稀

17、釋倍數(shù) OD 260 計(jì)量核酸OD 280 計(jì)量蛋白OD 230 計(jì)量鹽離子OD 320 計(jì)量背景,2×Taq PCR Mastermix,做PCR時(shí)的預(yù)混液，將除了模板、引物以外其他的組分按照最佳配比混合在一起的混合液，使用時(shí)直接加入模板和引物就可以，這樣做節(jié)省時(shí)間，也不用考慮反應(yīng)體系性能問題。一般包括緩沖液、鎂離子、酶和dNTP 。,PCR的基本步驟,,重復(fù)1~3步25~30輪,,,,,,,,,目的DNA片段擴(kuò)

18、增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA變性形成2條單鏈,DNA單鏈與引物復(fù)性,子鏈延伸DNA加倍,凝膠電泳,在生理?xiàng)l件下 ,核酸分子的糖- 磷 酸骨架中的磷酸基 因 呈離子狀態(tài) ,從這種意義上講 ,D N A 和 R N A 多核苷酸鏈可叫做 多聚 陰離 子 ( P ol yani o n s ) 。因 此 , 當(dāng)核 酸分 子 被放 置在 電場(chǎng)中時(shí) , 它們就會(huì)向正電極的 方向遷 移。由 于糖- 磷酸 骨架 結(jié)構(gòu) 上的重 復(fù)性 質(zhì)