小麥三個(gè)貯藏蛋白基因的克隆、原核表達(dá)及品質(zhì)效應(yīng)鑒定.pdf

1、小麥貯藏蛋白分兩種:麥谷蛋白(Glutenin)和醇溶蛋白(Gliadin)，麥谷蛋白也分兩種:高分子量谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）。小麥貯藏蛋白是小麥面粉加工品質(zhì)的決定性因素，其含量超過(guò)小麥籽粒蛋白總量的80％。本研究以課題組自主選育的優(yōu)質(zhì)小麥新品種

2、“西農(nóng)538”和“西農(nóng)558”的基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank中收錄的HMW-GS、LMW-GS和α-gliadin的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別從這兩個(gè)小麥品種中得到了三種蛋白的基因編碼序列各一條，并進(jìn)一步進(jìn)行了序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析，同時(shí)以“西農(nóng)538”中獲得的三條基因序列為目標(biāo)序列，誘導(dǎo)其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，然后通過(guò)蛋白純化和微量摻粉實(shí)驗(yàn)研究比較這三個(gè)表達(dá)蛋白各自對(duì)小麥面粉的品質(zhì)效

3、應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.利用設(shè)計(jì)的特異性引物，共得到了6條具有單一完整開(kāi)放閱讀框的基因序列。其中從“西農(nóng)538”中克隆得到的HMW-GS、LMW-GS和α-gliadin基因序列的GenBank登錄號(hào)分別為KX452083、KX452081、KX452085，編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為1812bp、915bp和897bp;從“西農(nóng)558”中克隆得到的這三種蛋白的基因序列的登錄號(hào)分別為KX452084、KX452082、KX452086，

4、編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為1977bp、915bp和879bp。
　　2.通過(guò)氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn):KX452083和KX452084主要由信號(hào)肽、N-端保守區(qū)、中間重復(fù)區(qū)和C-末端四個(gè)部分構(gòu)成，都有7個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，中間重復(fù)區(qū)有六肽和九肽重復(fù)單元，但沒(méi)有三肽重復(fù)單元，由此推測(cè)這兩個(gè)基因序列可能屬于y型亞基，同時(shí)經(jīng)過(guò)blastp比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析得知，兩條序列分別與1Dy10和1Dy12亞基有極高的相似度。KX452081和KX452

5、082主要由信號(hào)肽、N-端保守區(qū)、中間重復(fù)區(qū)(該區(qū)域是谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P)的富集區(qū)）、C-端保守區(qū)Ⅰ（含有5個(gè)Cys殘基）、C-端保守區(qū)Ⅱ(該區(qū)域含有豐富的谷氨酰胺(Q)和1個(gè)Cys殘基）和C-端保守區(qū)Ⅲ（含有1個(gè)Cys殘基）這六部分組成，通過(guò)序列比對(duì)、N/C端氨基酸組成(METRCIPG……VGTGVGAY)、Cys殘基的位置和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，得到的這兩條LMW-GS序列屬于Glu-D3位點(diǎn)、TypeⅤ(Group10)、m型

6、、C組LMW-GS。KX452085和KX452086主要由6部分組成:信號(hào)肽、N-端重復(fù)區(qū)、多聚谷氨酰胺區(qū)Ⅰ、特征區(qū)Ⅰ、多聚谷氨酰胺區(qū)Ⅱ和特征區(qū)Ⅱ，其中KX452085含有6個(gè)Cys殘基，可形成3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵;KX452086含有7個(gè)Cys殘基，不僅可以形成3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，多余的一個(gè)Cys殘基可能形成一個(gè)分子間二硫鍵。
　　3.依據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究目的和前人的研究成果，以“西農(nóng)538”中克隆得到的三條序列（KX452083、KX

7、452081和KX452085）為研究對(duì)象，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，使它們?cè)谒拗骶鶨scherichia coli Trans B(DE3)中進(jìn)行體外表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測(cè)鑒定，結(jié)果表明這三個(gè)蛋白均成功表達(dá)。
　　4.對(duì)三個(gè)蛋白進(jìn)行大量的體外表達(dá)，經(jīng)回收純化、低溫冷凍干燥和微量摻粉實(shí)驗(yàn)（以中國(guó)春面粉為基礎(chǔ)面粉），得到了一系列相關(guān)參數(shù)。分析這些參數(shù)發(fā)現(xiàn)，KX452083(HMW-GS)與面粉筋力正相

8、關(guān)，但對(duì)面團(tuán)彈性產(chǎn)生了負(fù)效應(yīng)，并且不利于面團(tuán)的延伸;KX452081(LMW-GS)對(duì)面粉筋力的影響比較復(fù)雜，尚難確定相關(guān)性，但其對(duì)面粉彈性有增強(qiáng)作用，而對(duì)面團(tuán)的延伸不利;KX452085(α-gliadin)對(duì)面粉筋力有負(fù)效應(yīng)，但使面團(tuán)更易流變，且對(duì)面團(tuán)的延伸和彈性有顯著的改善。此外，粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)（Farinograph quality number，F(xiàn)QN）是一種被用來(lái)評(píng)價(jià)面粉質(zhì)量的常用指標(biāo)，以FQN為衡量標(biāo)準(zhǔn)分析比較這三個(gè)蛋白的品