焦磷酸測序技術(shù)檢測慢性腎臟病患者Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化的研究.pdf

1、第一部分焦磷酸測序技術(shù)檢測慢性腎臟病患者Klotho基因啟動(dòng)子的超甲基化狀態(tài)
　　背景: DNA甲基化是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種表觀遺傳方式。焦磷酸測序技術(shù)是一種可進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析的DNA序列分析技術(shù);Klotho在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者和小鼠中呈現(xiàn)低表達(dá)，其機(jī)制尚不完全明了，Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化在其中可能起一定作用。本研究旨在利用焦磷酸測序技術(shù)檢測慢性腎臟病患者Kloth

2、o基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
　　方法: 2012年4月至2012年9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行腎臟活組織病理檢查的CKD患者47例，取得患者同意并簽署書面知情同意書。排除糖尿病、自身免疫性疾病、慢性肝臟疾病、活動(dòng)性感染、惡性腫瘤、吸煙、曾經(jīng)使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑的患者。以47例同期于我院行腎癌根治術(shù)患者腎臟切除標(biāo)本中的正常腎臟組織和48例健康志愿者的PBMC分別作為腎組織和PBMC的對照組。采用焦磷酸測序技術(shù)檢測腎活檢組織及外

3、周血單核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC) Klotho基因啟動(dòng)子甲基化水平。
　　結(jié)果: 47例CKD患者男性24例，女性23例，年齡42.89±13.91歲，蛋白尿1.94(IQR0.85-3.48) g/24h，eGFR31.30(IQR13.59-60.52) ml/min/1.73m2;47例腎組織對照組男性25例，女性22例，年齡48.23±9.35歲，蛋白尿0.03(

4、IQR0.00-0.19) g/24h，eGFR79.70(IQR70.74-101.35) ml/min/1.73m2;48例PBMC對照組男性24例，女性24例，年齡36.84±10.09歲，蛋白尿0.01(IQR0.00-0.10) g/24h，eGFR101.09(IQR91.55-115.34) ml/min/1.73m2。47例CKD患者腎組織標(biāo)本中，36例(76.6％)Klotho基因啟動(dòng)子CpG島呈現(xiàn)超甲基化，47例對照

5、組腎組織標(biāo)本中，Klotho基因啟動(dòng)子CpG島未呈現(xiàn)超甲基化現(xiàn)象，CKD患者腎組織Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于對照組(17.04±6.42 vs.9.34±2.43％，P＜0.001)。47例CKD患者PBMC標(biāo)本中，28例(59.6％)Klotho基因啟動(dòng)子CpG島呈現(xiàn)超甲基化，48例健康志愿者PBMC標(biāo)本中，Klotho基因啟動(dòng)子CpG島未呈現(xiàn)超甲基化現(xiàn)象，CKD患者PBMC Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于健康志愿

6、者(14.19±5.86 vs.6.90±2.39％，P＜0.001)。
　　結(jié)論: CKD患者的腎組織及PBMC Klotho基因甲基化率顯著高于對照組，超甲基化可能是導(dǎo)致CKD患者體內(nèi)Klotho低表達(dá)的機(jī)制之一。
　　第二部分慢性腎臟病患者外周血單核細(xì)胞Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率對腎組織Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化的評價(jià)作用
　　背景: 有研究顯示腫瘤患者PBMC的基因甲基化水平可以作為腫瘤組織基因甲基化水

7、平的生物標(biāo)志物，但因檢測方法、所檢測的目標(biāo)DNA片段及腫瘤類型不同而導(dǎo)致相關(guān)性不同。本研究旨在探討慢性腎臟病患者外周血單核細(xì)胞Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率對腎組織Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化的評價(jià)作用。
　　方法: 2012年4月至2012年9月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行腎臟活組織病理檢查的CKD患者47例，取得患者同意并簽署書面知情同意書。排除糖尿病、自身免疫性疾病、慢性肝臟疾病、活動(dòng)性感染、惡性腫瘤、吸煙、曾經(jīng)使用過糖皮質(zhì)激

8、素或免疫抑制劑的患者。采用焦磷酸測序技術(shù)檢測腎活檢組織及PBMCKlotho基因啟動(dòng)子甲基化水平，并由兩位病理醫(yī)師對腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化占皮質(zhì)腎組織面積的百分比進(jìn)行評價(jià)。
　　結(jié)果: 47例CKD患者男性24例，女性23例，年齡42.89±13.91歲，蛋白尿1.94(IQR0.85-3.48) g/24h, eGFR31.30(IQR13.59-60.52) ml/min/1.73m2。 CKD患者PBMC與腎組織Klotho

9、基因啟動(dòng)子甲基化率呈顯著正相關(guān)(r=0.811，P＜0.001)，PBMC Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率預(yù)測腎組織Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化的受試者工作曲線下面積為0.958(P＜0.001)。CKD患者腎組織和PBMCKlotho基因啟動(dòng)子甲基化率與eGFR呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.827，P＜0.001;r=-0.626，P＜0.001)，與腎小管間質(zhì)纖維化面積呈顯著正相關(guān)(r=0.865，P＜0.001; r=0.748，P＜

10、0.001)，與24小時(shí)尿蛋白無顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論: 慢性腎臟病患者PBMC與腎組織Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率呈正相關(guān)，可作為腎組織Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化的無創(chuàng)評價(jià)指標(biāo)。Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率升高與eGFR下降和腎小管間質(zhì)纖維化面積增加相關(guān)，其在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用值得進(jìn)一步研究。
　　第三部分 IgA腎病患者外周血單核細(xì)胞Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率與臨床病理特征的關(guān)系
　　背景: IgA

11、腎病是最常見的原發(fā)性慢性腎小球腎炎，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者PBMC Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率顯著升高，且與腎組織Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率呈正相關(guān)，可作為腎組織Klotho基因啟動(dòng)子超甲基化的無創(chuàng)評價(jià)指標(biāo)。本研究主要探討IgA腎病患者PBMC的Klotho基因啟動(dòng)子甲基化率與其臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法: 2012年8月～2013年2月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科病房住院治療并于住院期間行腎臟活組織病理檢查

12、，術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性IgA腎病的臨床和病理資料完整的患者，取得患者知情同意。采用焦磷酸測序法檢測患者PBMCKlotho基因啟動(dòng)子的甲基化率，腎小球、腎小管及血管的各項(xiàng)病理參數(shù)的半定量積分采用Katafuchi評分標(biāo)準(zhǔn)，分析PBMC Klotho基因啟動(dòng)子的甲基化率與IgA腎病的臨床病理特征的關(guān)系。
　　結(jié)果: 86例IgA腎病患者男女比為男性35例，女性51例，年齡35.77±11.03歲，eGFR86.41 ml/min/1

13、.73 m2(IQR66.85-104.34ml/min/1.73m2).eGFR≥60ml/min/1.73m2組的PBMC Klotho啟動(dòng)子甲基化率顯著低于eGFR＜60ml/min/1.73m2組(5.38±1.42％ vs.6.46±1.98％，P＜0.05)。經(jīng)單因素相關(guān)分析，IgA腎病患者eGFR與男性(p=-0.216，P＜0.05)、年齡(r=-0.469，P＜0.001)、平均動(dòng)脈壓(r=-0.331，P＜0.01)

14、、PBMC Klotho甲基化率(r=-0.281，P＜0.01)呈顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步對男性、年齡、平均動(dòng)脈壓、PBMC Klotho啟動(dòng)子甲基化率進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)eGFR與年齡(P＜0.01)、PBMC Klotho啟動(dòng)子甲基化率(P＜0.05)呈負(fù)相關(guān)，與男性、平均動(dòng)脈壓無相關(guān)性。IgA腎病患者PBMC Klotho啟動(dòng)子甲基化率與間質(zhì)纖維化積分呈正相關(guān)(p=0.273，P＜0.05)，與腎小球增殖程度積分、節(jié)段損害積分、球性