隱球菌通過(guò)S100A10活化尿激酶-纖溶酶系統(tǒng)侵襲血腦屏障的機(jī)制研究.pdf

1、隱球菌一種機(jī)會(huì)致病菌，一般分布于環(huán)境土壤中，不寄居于人體。近年來(lái)，隱球菌侵犯人類(lèi)每年新增的隱球菌病人全球共高達(dá)百萬(wàn)人，尤其是侵犯人腦血腦屏障后，死亡率很高，治療比較困難。人類(lèi)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中一類(lèi)蛋白，S100A10蛋白是鈣結(jié)合蛋白家族中S100蛋白中的一種，分子量大小為11KD，也稱(chēng)p11蛋白。在細(xì)胞液和細(xì)胞核中都有存在，經(jīng)常與膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合作為跨膜蛋白在維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)中起到重要的作用。人體內(nèi)環(huán)境血液系統(tǒng)中含有微量的未激活的

2、纖溶酶原，而內(nèi)皮細(xì)胞中的S100A10蛋白可以結(jié)合未被激活的纖溶酶原蛋白，通過(guò)改變纖溶酶原蛋白的空間位象，起到催化使其更加容易被尿激酶(UPA)激活的一種橋梁性的作用。研究也表明隱球菌和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后，S100A10在mRNA水平升高。S100A10在細(xì)胞膜上的位置與尿激酶受體的空間位置非常接近，隱球菌通過(guò)上調(diào)細(xì)胞的S100A10的基因表達(dá)使隱球菌莢膜表面結(jié)合的纖溶酶原更多的被催化，使其更加容易被激活，并且細(xì)胞膜上的S100A

3、10蛋白結(jié)合隱球菌上的纖溶酶原時(shí)，距離尿激酶受體很近。在隱球菌侵襲細(xì)胞時(shí)，有國(guó)外研究文獻(xiàn)證明隱球菌可以在沒(méi)有組織纖溶酶原(tPA)存在的時(shí)候下，使細(xì)胞自身表達(dá)尿激酶，從而尿激酶將尿激酶受體附近的經(jīng)S100A10催化過(guò)的大量纖溶酶原激活為有活性的纖溶酶，進(jìn)而纖溶酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)層，使隱球菌通過(guò)細(xì)胞旁路途徑更易通過(guò)血腦屏障。本實(shí)驗(yàn)就隱球菌和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后的S100A10的作用，進(jìn)行進(jìn)一步的研究和論證。
　　目的：
　　

4、證明隱球菌可以通過(guò)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞S100A10基因的上調(diào)來(lái)活化尿激酶-纖溶酶系統(tǒng)，進(jìn)而隱球菌可以更容易的穿過(guò)血腦屏障。
　　方法：
　　第一部分:設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，用小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3和新生隱球菌B3501株共孵育，孵育時(shí)間為0h、2h、4h、8h、16h、24h，進(jìn)行Real-time Quantitative PCR和Western-blot分別檢測(cè)S100A10和尿激酶分別在mRNA水平和蛋白水平的表

5、達(dá)量。
　　第二部分:進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建、檢測(cè)感染效率，摸索bEnd.3細(xì)胞最佳的感染條件，并且用Real-time Quantitative PCR和Western-blot檢測(cè)沉默S100A10基因后，尿激酶基因和S100A10基因共同在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量。
　　第三部分:設(shè)置沉默S100A10后的小鼠血腦屏障transwell體外模型為實(shí)驗(yàn)組，未沉默S100A10基因的正常bEnd.3細(xì)胞為對(duì)照組，分別和

6、野生型B3501株進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)通過(guò)模型菌的量。用底物顯色試劑S-2444和S-2251檢測(cè)尿激酶-纖溶酶系統(tǒng)的相關(guān)活化情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分共孵育的時(shí)間越長(zhǎng)，S100A10和UPA基因在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的量也越高。其中S100A10在2h、16h、24h組在mRNA差異明顯，t檢驗(yàn)，P＜0.05;S100A10蛋白在24h組有差異性，t檢驗(yàn)，P＜0.05; UPA基因在16h、24h組的mRNA與對(duì)

7、照組有明顯差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，p＜0.05; UPA蛋白在8h、16h、24h組與對(duì)照組有明顯差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，p＜0.05。
　　第二部分構(gòu)建S100A10基因慢病毒后，發(fā)現(xiàn)其感染bEnd.3細(xì)胞在MOI值為20時(shí)為最佳有效值且bEnd.3細(xì)胞形態(tài)正常;沉默S100A10基因后，S100A10基因和UPA基因在mRNA水平和蛋白水平分別對(duì)應(yīng)相應(yīng)的正常對(duì)照組均下降，且有明顯的差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，P值均＜0.05
　　第三部分 S100

8、A10正常組和沉默組分別構(gòu)建的Transwell模型，通過(guò)模型的菌落數(shù)隨著共孵育的時(shí)間延長(zhǎng)，總體趨勢(shì)是增加的。尤其是菌落數(shù)在8h組、16h組、24h組有明顯的差異性經(jīng)t檢驗(yàn)p＜0.05;與此同時(shí)在被新生隱球菌激活各組的尿激酶和纖溶酶的量也有顯著差異性，纖溶酶蛋白組在8h、16h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)有明顯差異，t體檢P＜0.05;尿激酶蛋白組在16h、24h兩個(gè)時(shí)間組有明顯差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，P＜0.05
　　結(jié)論：
　　隱球菌能通