sigma-1受體基因缺失誘發(fā)抑郁樣行為的機制研究.pdf

1、背景:sigma-1受體(σ1R)主要在海馬、下丘腦及杏仁核的神經(jīng)細胞中表達。σ1R活化能增強海馬CA1區(qū)（Comu Ammonis1field）錐體細胞N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDA受體)介導(dǎo)的鈣離子(Ca2+)內(nèi)流，增加鈣調(diào)蛋白(calmodulin)的活性，提高細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化水平和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的轉(zhuǎn)錄水平，易化突觸可塑性長時程增強(LTP)的誘導(dǎo)。同時，σ1R活化對GABA

2、A受體有負(fù)向調(diào)控作用。此外，σ1R活化能增強電壓門控鈣離子通道開放來增加鈣離子內(nèi)流。σ1R基因敲除小鼠有抑郁樣的表型，但是迄今有關(guān)其分子機制仍然沒有闡明。
　　基底外側(cè)杏仁核（BLA）神經(jīng)元被認(rèn)為是調(diào)節(jié)情感行為的重要腦區(qū)之一，小鼠BLA的錐體神經(jīng)元表達σ1R。BLA主要包括兩種類型的神經(jīng)元:谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能中間神經(jīng)元。大量的研究證明，來自于皮層外囊（EC）的神經(jīng)纖維末梢與BLA谷氨酸能神經(jīng)元構(gòu)建了興奮性神經(jīng)通路，GABA

3、A受體介導(dǎo)了BLA的抑制性局部回路。谷氨酸能神經(jīng)元的突觸可塑性LTP和長時程抑制（LTD）都參與了恐懼記憶的形成和抑郁-焦慮行為的發(fā)生，如LTP是恐懼記憶形成的分子基礎(chǔ)，而LTD的誘導(dǎo)能消除形成的恐懼記憶。LTP誘導(dǎo)依賴于NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+的內(nèi)流，GABAA受體介導(dǎo)的抑制性局部回路與LTD的誘導(dǎo)密切相關(guān)。此外，NMDA受體的鈣離子內(nèi)流通過活化突觸后致密蛋白（PSD-95），促進PSD-95與神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)的結(jié)合

4、從而增加一氧化氮(NO)的產(chǎn)生和逆行性釋放，這可以增加突觸前膜的谷氨酸釋放?；谏鲜龇治?，本研究提出“σ1R缺失有可能通過影響B(tài)LA的突觸可塑性誘發(fā)抑郁樣行為”的科研設(shè)想。
　　研究目的:
　　1.明確σ1R缺失對BLA神經(jīng)回路和突觸可塑性的影響及其分子機制;
　　2.闡明σ1R缺失影響B(tài)LA的突觸可塑性在小鼠抑郁樣行為發(fā)生中的作用。
　　實驗方法:
　　1.σ1R基因敲除小鼠（σ1R-KO小鼠）由美國Ca

5、lifornia的Zollila教授提供。提取小鼠尾巴的DNA，用PCR方法進行小鼠的基因型鑒定。
　　2.行為學(xué)檢測:用曠場實驗(OFT)評價小鼠的自主運動和探知行為。用懸尾試驗(TST)和強迫游泳試驗(FST)檢測小鼠的抑郁樣行為。
　　3.形態(tài)學(xué)檢測:制備BLA石蠟?zāi)X片，用甲苯胺藍染色觀察BLA區(qū)神經(jīng)元的形態(tài);進行BLA區(qū)的σ1R免疫組織化學(xué)染色觀察σ1R的表達。
　　4.用場電位記錄外囊和BLA谷氨酸神經(jīng)元的突

6、觸（EC-BLA突觸）傳遞效應(yīng)，雙脈沖易化（PPF，評價突觸前谷氨酸釋放）和雙脈沖抑制（PPI，評價抑制性神經(jīng)回路功能），用高頻刺激（HFS，100 Hz，1 min×5 times）誘導(dǎo)LTP，用低頻刺激(LFS，1 Hz，15 min)誘導(dǎo)LTD。
　　5.用ELISA試劑盒檢測BLA腦區(qū)的NO水平。
　　6.用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白印跡(WB)的方法檢測BLA區(qū)nNOS和PSD-95的結(jié)合能力;檢測nNOS、P

7、SD-95、calmodulin、NMDA受體亞基NR2A和NR2B的磷酸化水平。
　　7.用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測AMPA受體、NMDA受體、GABAA受體的mRNA水平。
　　實驗結(jié)果:
　　1.σ1R免疫組織染色結(jié)果顯示，野生型(WT)小鼠BLA區(qū)的大型神經(jīng)元（谷氨酸神經(jīng)元）表達σ1R。BLA腦區(qū)甲苯胺藍細胞染色結(jié)果顯示，與同齡WT小鼠相比，σ1R-KO小鼠神經(jīng)元的數(shù)量和形態(tài)都沒有明顯改變。

8、r>　　2.與WT小鼠相比，σ1R-KO小鼠BLA的EC-BLA突觸傳遞的興奮性突觸后電位(fEPSP)斜率明顯降低，雙脈沖易化(PPF)值明顯增加，提示σ1R缺失→減少谷氨酸釋放→突觸傳遞功能降低。
　　3.與WT小鼠相比，σ1R-KO小鼠BLA的AMPA受體（GluR1、GluR2）、NMDA受體(NR1、NR2B、NR2A)和GABAA受體（GABAAR-α4、GABAAR-δ）mNRA水平?jīng)]有明顯改變，然而NR2B亞基的磷

9、酸化水平顯著降低，NR2A亞基的磷酸化水平?jīng)]有改變，提示σ1R缺失能降低NMDA受體功能。
　　4.與WT小鼠相比，盡管σ1R-KO小鼠BLA的nNOS、PSD-95和calmodulin的蛋白水平?jīng)]有明顯改變，然而nNOS和PSD-95的結(jié)合水平顯著降低，NO水平也降低。NMDA受體激動劑NMDA的BLA區(qū)微注射可以恢復(fù)nNOS和PSD-95的結(jié)合和NO產(chǎn)生，提示σ1R缺失→NMDA受體下調(diào)→降低nNOS與PSD-95結(jié)合→減少

10、NO生成。
　　5.在σ1R-KO小鼠腦片，NMDA或者NO供體DETA/NO處理能恢復(fù)fEPSP斜率和PPF值;nNOS抑制劑7-NI可以阻斷NMDA的作用，提示σ1R缺失→減少NO生成→抑制谷氨酸釋放。
　　6.HFS能誘導(dǎo)WT小鼠產(chǎn)生NMDA受體依賴性LTP，但是在σ1R-KO小鼠HFS不能誘導(dǎo)LTP。在σ1R-KO小鼠腦片，NMDA處理能恢復(fù)LTP的誘導(dǎo)，7-NI會拮抗NMDA的作用，提示σ1R缺失→NMDA受體下調(diào)

11、→阻止LTP誘導(dǎo)。
　　7.與WT小鼠相比，σ1R-KO小鼠BLA的PPI值明顯增加。GABAA受體激動劑muscimol和NMDA處理能恢復(fù)σ1R-KO小鼠的PPI值。在WT小鼠腦片，GABAAR阻斷劑bicuculine處理能增加PPI值，提示σ1R缺失→減弱GABAAR介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)回路。
　　8.LFS能誘導(dǎo)WT小鼠產(chǎn)生LTD，但是在σ1R-KO小鼠LFS不能誘導(dǎo)LTD。 bicuculine能阻斷WT小鼠的LTD

12、誘導(dǎo)。muscimol，NMDA和DETA/NO均可以恢復(fù)σ1R-KO小鼠LTD，提示σ1R缺失→減弱GABAA受體介導(dǎo)的抑制性回路→損害LTD的誘導(dǎo)。
　　9.與WT小鼠相比，σ1R-KO小鼠在強迫游泳和懸尾試驗中的不動時間明顯延長。在σ1R-KO小鼠BLA區(qū)注射NMDA、DETA和muscimol可以逆轉(zhuǎn)強迫游泳和懸尾試驗中的時間延長，7-NI能拮抗NMDA的作用，提示σ1R缺失→阻礙BLA的LTD誘導(dǎo)→引起抑郁樣行為。