LYRM1基因沉默致心肌樣細胞凋亡的線粒體機制研究.pdf

1、心臟發(fā)育的過程是極其復雜的，涉及不同時間和空間的一系列胚胎發(fā)育相關基因的順序表達。心臟結構和功能對心臟發(fā)育相關基因的擾動相當敏感。在心臟發(fā)育相關基因網(wǎng)絡中，任何一個基因突變都可能導致先天性心臟病的發(fā)生。因此，先天性心臟病遺傳學病因的探索仍然是預防和治療該病的關鍵。
　　LYRM1(LYR motif containing1)基因是郭錫熔教授課題組發(fā)現(xiàn)并克隆得到的一條人類新基因。令人驚訝的是，多組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)LYRM1基因除了在

2、人類脂肪組織中高豐度表達外，在心臟組織中同樣呈現(xiàn)高豐度表達。另外，研究表明LYRM1是LYR超家族復合體1的成員，而LYR蛋白主要是線粒體蛋白質，影響線粒體內穩(wěn)態(tài)。郭錫熔教授課題小組成員發(fā)現(xiàn)LYRM1在3T3-L1前體脂肪細胞的增值、凋亡及分化過程均扮演重要角色，且具有損傷3T3-L1成熟脂肪細胞線粒體功能作用。鑒于心臟和脂肪均來源于中胚層，來源于相同胚層的組織具有相似的結構與功能，因此提示LYRM1也可能參與心臟發(fā)生發(fā)育的生理過程。本

3、研究小組探索了LYRM1基因過表達在P19細胞向心肌樣細胞分化過程的作用，結果顯示LYRM1基因過表達雖然不影響P19細胞向心肌樣細胞的分化，但是能顯著誘導P19細胞的增殖、明顯抑制P19細胞凋亡。因此，我們推測LYRM1基因在心臟發(fā)育中可能占有重要作用。
　　為進一步探討心臟發(fā)育過程中LYRM1基因的功能角色，我們選擇P19細胞作為研究對象，運用RNA干擾技術使LYRM1基因表達沉默，進而探索LYRM1基因表達沉默對P19細胞增

4、殖、凋亡和分化的影響，以及對P19誘導分化的心肌樣細胞線粒體功能的影響。深度分析LYRM1基因對心肌樣細胞凋亡的影響及凋亡作用與線粒體功能之間的關系，進一步論證在胚胎心臟發(fā)育過程中LYRM1基因的重要作用及致畸的可能機制，這將為先天性心臟病的病理生理學的基礎研究提供新線索。
　　第一部分 LYRM1基因表達沉默對P19細胞增殖凋亡及分化的影響
　　目的:探索LYRM1基因表達沉默對P19細胞增殖、凋亡及分化的影響。
　

5、　方法:設計LYRM1干擾靶序列，構建LYRM1基因短發(fā)夾狀RNA的慢病毒載體pgLV-U6-puro-LYRM1-shRNA，對照組為pgLV-U6-puro-NC-shRNA。將pgLV-U6-puro-LYRM1-shRNA或pgLV-U6-puro-NC-shRNA轉染到HEK-293T細胞并獲得病毒上清，感染P19細胞并用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉染的P19細胞。定量PCR檢測LYRM1基因沉默干擾效果;細胞計數(shù)盒(CCK-8)檢

6、測其對P19細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測細胞周期、分析Caspase-3的活性及檢測細胞凋亡;倒置顯微鏡觀察P19細胞向心肌樣細胞分化過程中細胞形態(tài)的改變;定量PCR及Western blot檢測心肌細胞分化過程中的心肌標志物基因(GATA4和Nkx2-5)的表達水平。
　　結果:1）LYRM1基因沉默明顯抑制P19細胞增殖，表現(xiàn)為:促進細胞進入G1期，受阻于S期;2)LYRM1基因沉默顯著促進P19細胞凋亡;3）沉默LYRM1

7、基因的P19細胞分化過程中，細胞邊緣模糊，不規(guī)整。心肌標志物GATA4和Nkx2-5的基因表達水平均在心肌細胞分化第6天和第10天顯著下降，蛋白表達水平在分化第6天前均無明顯變化，但第10天明顯下降。
　　結論: LYRM1基因表達沉默具有抑制P19細胞的增值、促進其凋亡以及抑制P19細胞向心肌樣細胞分化的作用，提示LYRM1基因在胚胎心臟發(fā)育過程可能占有重要作用。
　　第二部分 LYRM1基因表達沉默對P19細胞誘導分化的

8、心肌樣細胞線粒體功能的影響
　　目的:探討LYRM1基因表達沉默對P19細胞誘導分化的心肌樣細胞線粒體功能的影響。
　　方法:穩(wěn)定轉染LYRM1基因沉默病毒的P19細胞株，經1％DMSO誘導分化成為心肌樣細胞。以誘導分化第10天的心肌樣細胞為研究對象，采用熒光定量PCR技術檢測線粒體DNA拷貝數(shù);ATP檢測試劑盒檢測細胞ATP含量;采用DCFDA(2，7-Dichlorofluorescein diacetate，DCFDA

9、)熒光探針、熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的改變;應用JC-1（Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1）熒光探針、熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化。
　　結果:1）LYRM1基因沉默對心肌樣細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)無明顯影響;2) LYRM1基因沉默的心肌樣細胞中ATP含量顯著降低;3）LY