前額葉皮層突觸前Sigma-1受體對(duì)D1受體的協(xié)同作用及機(jī)制.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、前額葉皮層突觸前Sigma-1受體對(duì)D1受體的協(xié)同作用及機(jī)制
　　 Sigma受體早在1976年就被Martin等人發(fā)現(xiàn)，是非阿片、非苯環(huán)利定類受體。藥理學(xué)分析表明sigma受體包括2個(gè)亞型：sigma-1和sigma-2受體。其中sigma-1受體已被克隆，與其他受體沒有同源性，廣泛分布于哺乳動(dòng)物腦中，與學(xué)習(xí)和記憶、精神分裂癥、心理渴求和覓藥行為以及藥物介導(dǎo)的行為敏化等過程關(guān)系密切。

2、
　　 我們課題組進(jìn)行的另一項(xiàng)研究表明：sigma-1受體促進(jìn)谷氨酸釋放的效應(yīng)或許是由D1受體介導(dǎo)的。為了進(jìn)一步研究sigma-1受體是如何協(xié)同D1受體及其相互作用的環(huán)節(jié)，本文擬用突觸小體(synaptosomes)作為研究突觸末梢突觸前部分的模型，同時(shí)采用生物化學(xué)方法結(jié)合藥理學(xué)手段觀察sigma-1受體和D1受體相互作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明：(1)前額葉皮層突觸前sigma-1受體激動(dòng)劑PRE084，SKF10047能夠放大

3、D1受體激動(dòng)劑SKF38393激活的PKA活性增強(qiáng)，sigma-1受體拮抗劑BMY14802能阻斷其放大作用。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示前額葉皮層突觸前表達(dá)Sigma-1受體蛋白。(2)Sigma-1受體激動(dòng)劑能夠放大膜可通透性cAMP類似物CPT-cAMP誘導(dǎo)的PKA活性增強(qiáng)、也能夠放大腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑forskolin誘導(dǎo)的PKA活性增強(qiáng)，而對(duì)D1受體誘導(dǎo)的AC活性增強(qiáng)沒有作用，由此推測(cè)sigma-1受體激動(dòng)劑通過D1

4、受體下游的cAMP放大D1受體激活的PKA活性增強(qiáng)，從而參與調(diào)節(jié)前額葉皮層突觸前谷氨酸釋放。(3)PKC廣譜抑制劑chelerythrine能夠阻斷sigma-1受體激動(dòng)劑的放大作用，同時(shí)PKC激動(dòng)劑PDBu能夠模擬sigma-1受體激動(dòng)劑的放大作用。接下來(lái)又使用cPKC抑制劑rottlerin和cPKCβ抑制劑CGP53353(4μM)，結(jié)果證實(shí)sigma-1受體活化后下游的PKC，特別是cPKCβI，在放大D1受體信號(hào)的過程中起重要

5、作用。同時(shí)，Westernblot結(jié)果也證實(shí)了激活前額葉皮層突觸前sigma-1受體會(huì)引起cPKCβI膜轉(zhuǎn)位。(4)實(shí)驗(yàn)中還驗(yàn)證了Ca2+是否參與sigma-1受體的協(xié)同作用。結(jié)果顯示無(wú)Ca2+勻漿液及Ca2+螯合劑EGTA、電壓依賴性Ca2+通道阻斷劑cadmium，L-型Ca2+通道阻斷劑nimodipin都能夠阻斷sigma-1受體的協(xié)同作用。以上結(jié)果提示，激活前額葉皮層突觸前sigma-1受體，通過活化下游PKC，特別是cPKC

6、β I，以及L-型Ca2+通道從而增加突觸小體內(nèi)Ca2+濃度，以此放大D1受體下游信號(hào)。這一研究不僅對(duì)揭示sigma-1受體和D1受體相互作用的作用機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也對(duì)揭示sigma-1受體在腦內(nèi)的功能及其作用機(jī)制提供了有力的證據(jù)，對(duì)臨床藥物的設(shè)計(jì)提供了有效的參考價(jià)值。
　　 第二部分、前額葉皮層突觸前磷脂酰肌醇(PI)偶聯(lián)的D1受體對(duì)經(jīng)典型D1受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及作用機(jī)制
　　 多巴胺(dopamine, DA)

7、是最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一。分子生物學(xué)的研究證明DA受體有D1, D2, D3, D4和D5 5種亞型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體。除了由Gαs介導(dǎo)的D1受體的PKA途徑(經(jīng)典D1受體途徑，D1 receptor/cAMP/PKA pathway )D1受體還可以調(diào)節(jié)PLC/IP3信號(hào)通路的活性。與經(jīng)典型D1受體(D1receptor/cAMP/PKA)不同，這型受體被稱為磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)偶聯(lián)的D1受體

8、。文獻(xiàn)報(bào)道，磷脂酰肌醇偶聯(lián)的D1受體激動(dòng)劑SKF83959激活磷脂酰肌醇偶聯(lián)的D1受體的同時(shí)對(duì)經(jīng)典D1受體途徑激活的cAMP/PKA活性有抑制作用，但PI偶聯(lián)的D1受體激動(dòng)劑SKF83959是否作用于經(jīng)典D1受體途徑及其相互作用的環(huán)節(jié)尚無(wú)報(bào)道，是直接作用還是間接作用都需要進(jìn)一步探討。
　　 為探討這一問題，本文擬用突觸小體(synaptosomes)作為研究突觸末梢突觸前部分的模型，同時(shí)采用生物化學(xué)方法結(jié)合藥理學(xué)手段觀察PI偶聯(lián)

9、的D1受體途徑(PI-linked D1-like receptors pathway)和經(jīng)典D1受體途徑相互作用及作用機(jī)制。結(jié)果顯示，(1) SKF83959單獨(dú)對(duì)PKA活性沒有影響，但是可以減弱經(jīng)典型D1受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PKA活性增強(qiáng)，并且這種調(diào)節(jié)作用能被SKF83959下游的PLCβ阻斷劑U-73122阻斷。(2)廣譜PKC抑制劑chelerythrine, cPKC特異性抑制劑rottlerin以及cPKCα,β特異性抑制劑Go

10、6976能夠阻斷PI偶聯(lián)的D1受體途徑對(duì)經(jīng)典D1受體途徑的調(diào)節(jié)作用，而PKCβⅠ,Ⅱ特異性阻斷劑CGP53353不能阻斷其調(diào)節(jié)作用，由此初步推測(cè)PI偶聯(lián)的D1受體通過激活下游的cPKCα來(lái)調(diào)節(jié)經(jīng)典D1受體途徑，Western blot結(jié)果顯示SKF83959能夠使cPKCα膜轉(zhuǎn)位，激活cPKCα。(3)無(wú)Ca2+勻漿液、Ca2+螯合劑EGTA和CdkS抑制劑butyrolactone能夠阻斷PI偶聯(lián)的D1受體對(duì)經(jīng)典型D1受體的調(diào)節(jié)作用，

11、并且Western blot結(jié)果顯示SKF83959能夠使突觸小體中DARPP-32蛋白Thr75位點(diǎn)磷酸化，而不影響Thr34位點(diǎn)磷酸化水平及DARPP-32蛋白表達(dá)。由此可以初步得出以下結(jié)論：SKF83959激活PI偶聯(lián)的D1受體并且通過其下游的cPKCα，Ca2+以及PP2B-Cdk5介導(dǎo)DARPP-32 Thr75位點(diǎn)磷酸化從而下調(diào)經(jīng)典型D1受體激活的PKA活性增強(qiáng)。這一研究不僅對(duì)揭示PI偶聯(lián)的D1受體途徑(PI-linked