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文檔簡介
1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種進化上高度保守的絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶,屬于磷脂酰肌醇激酶(PI3K)相關(guān)激酶蛋白質(zhì)家族成員。mTOR在細胞的生長、代謝、存活中起重要作用,其在細胞內(nèi)可形成兩種多蛋白復(fù)合體:mTORC1和mTORC2。 mTORC1主要組成蛋白是Raptor、mTOR、GβL、DEPTOR和PRAS40,mTORC2主要由Rictor、mTOR、GβL和S
2、IN1組成。其中Raptor和Rictor分別是定義mTORC1和mTORC2的關(guān)鍵蛋白。mTORC1與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)合成,細胞生長代謝等有關(guān),mTORC2可磷酸化下游Akt、PKC等蛋白,調(diào)控胚胎發(fā)育、腫瘤形成、心肌缺血損傷時的心肌保護等。研究報道,mTORC2缺失可阻滯胚胎和胚外組織的發(fā)育,但關(guān)于mTORC2在心臟發(fā)育中功能和機制的研究還處于初始階段,亟待進一步探索。胚胎干(Embryonic Stem,ES)細胞是一種來源于囊胚期內(nèi)
3、細胞團,可進行自我更新和分化為生物體內(nèi)各種不同類型細胞的全能干細胞。ES細胞可體外定向分化為功能性心肌細胞,已應(yīng)用于心臟疾病的細胞再生治療、新藥發(fā)現(xiàn)等研究領(lǐng)域,但心肌細胞分化是一個復(fù)雜過程,其中的調(diào)控機制目前尚沒有完全研究清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)干擾Rictor/mTORC2可抑制ES細胞定向心肌細胞分化,且可導(dǎo)致分化后心肌細胞肌小節(jié)排列不規(guī)則、電生理功能紊亂等現(xiàn)象,但關(guān)于Rictor/mTORC2如何調(diào)控ES細胞定向分化為心肌細胞的
4、機制尚不明確,亟待深入探索。
目的:利用小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞模型,探索Rictor/mTORC2對ES細胞定向分化心肌細胞線粒體功能的調(diào)控作用及機制,揭示Rictor/mTORC2的定位表達與心肌細胞中MAM結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)聯(lián)性;闡明Rictor/mTORC2經(jīng)由線粒體Cx43調(diào)控心肌細胞線粒體功能的相關(guān)機制。
方法:采用慢病毒技術(shù)干擾小鼠ES細胞中Rictor表達,通過經(jīng)典“懸滴-懸浮-貼壁”三步法建立
5、小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞模型。利用Western Blot技術(shù)考察在ES細胞定向心肌細胞分化過程中Rictor表達變化。采用免疫熒光、Western Blot及免疫共沉淀技術(shù)考察Rictor在ESC-CMs中定位情況。利用流式細胞術(shù)和WesternBlot檢測干擾Rictor對小鼠ES細胞定向心肌分化的影響。采用MTT法檢測干擾Rictor對小鼠ES細胞活性影響。利用Western Blot考察干擾Rictor對mTORC2其
6、它組分(SIN1,GβL,mTOR,p-mTORSer2481)以及p-AktSer473表達水平的影響。采用ATP試劑盒檢測干擾Rictor對ESC-CMs中ATP產(chǎn)生的影響。用JC-1染色和流式細胞術(shù)考察干擾Rictor后ESC-CMs線粒體膜電位變化。利用Western Blot技術(shù)檢測干擾Rictor對ESC-CMs中凋亡早期蛋白細胞色素C表達的影響。采用透射電鏡技術(shù)考察干擾Rictor對ESC-CMs超微結(jié)構(gòu)(線粒體、MAM結(jié)
7、構(gòu))的影響。通過Western Blot技術(shù)檢測干擾Rictor對ESC-CMs中Mfn2表達的影響。用免疫共沉淀技術(shù)檢測IP3R-Grp75-VDAC1結(jié)合情況,考察干擾Rictor對ESC-CMs中MAM偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的影響。通過活細胞工作站測定分化后心肌細胞線粒體鈣瞬變。采用WesternBlot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)考察干擾Rictor對ESC-CMs中Cx43、HDAC6表達水平的影響。運用免疫共沉淀技術(shù)考察干擾Rictor對ESC-C
8、Ms中Cx43與Hsp90、TOM20,Hsp90與acetyl lysine結(jié)合的影響。用慢病毒技術(shù)特異性過表達小鼠ES細胞線粒體Cx43,采用ATP試劑盒和流式細胞術(shù)檢測過表達線粒體Cx43對ESC-CMs中ATP產(chǎn)生以及線粒體膜電位的影響。同時采用流式細胞術(shù)考察過表達線粒體Cx43對心肌細胞分化率的影響。利用線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性檢測試劑盒檢測干擾Rictor及過表達線粒體Cx43對ESC-CMs酶復(fù)合物活性的影響
9、。利用熒光染色及免疫共沉淀技術(shù)檢測ESC-CMs中基質(zhì)蛋白CypD與內(nèi)膜蛋白ANT的相互作用來評價mPTP開放情況。用Western Blot技術(shù)檢測干擾Rictor對Akt、p-AktSer473、GSK3β、p-GSK3βSer9表達水平的影響。采用免疫共沉淀技術(shù)考察ESC-CMs中Cx43、p-Cx43 Ser368、ANT、CypD、GSK3β、p-GSK3βSer9相互結(jié)合及干擾Rictor和過表達線粒體Cx43對這種相互作用
10、的影響。
結(jié)果:⑴在小鼠ES細胞分化為心肌細胞過程中,Rictor表達逐漸上調(diào)。ES細胞干擾Rictor導(dǎo)致其定向心肌細胞分化率顯著下降,心肌特異性蛋白α-Actinin顯著下調(diào)。Rictor主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及MAM結(jié)構(gòu)。免疫熒光和免疫共沉淀結(jié)果顯示,在ESC-CMs中,Rictor與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有很好共疊加,且與MAM結(jié)構(gòu)中IP3R、Grp75、VDAC1有相互作用。mTORC2組成成分中表征mTORC2活性及完整性的Ri
11、ctor、SIN1、p-mTORSer2481和p-AktSer473在干擾Rictor后表達顯著下調(diào)。干擾Rictor后擬胚體(embryoid bodies,EBs)(day5)和ESC-CMs(day5+3)的ATP產(chǎn)量顯著降低。JC-1染色及流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Rictor組ESC-CMs線粒體膜電位顯著下降,但細胞色素C無顯著變化。透射電鏡結(jié)果顯示,干擾Rictor組ESC-CMs線粒體內(nèi)嵴腫脹,出現(xiàn)空泡,而對照組線粒體內(nèi)嵴
12、排列整齊,提示干擾Rictor可使分化后心肌細胞線粒體形態(tài)出現(xiàn)損傷。活細胞工作站結(jié)果顯示,干擾Rictor后ATP刺激引起的線粒體鈣瞬變幅度較對照組顯著下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)干擾Rictor引起MAM結(jié)構(gòu)減少,且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體重疊率顯著下降,MAM結(jié)構(gòu)復(fù)合物IP3R-Grp75-VDAC1相互結(jié)合減弱,Mfn2表達減少,說明干擾Rictor導(dǎo)致ESC-CMs中MAM結(jié)構(gòu)受到破壞,可能是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體鈣穿梭減少的原因之一。以上結(jié)果提示干
13、擾Rictor可導(dǎo)致ESC-CMs線粒體ATP產(chǎn)生減少,膜電位下降,線粒體出現(xiàn)腫脹及空泡,但不引起細胞凋亡。同時干擾Rictor減少ESC-CMs中MAM結(jié)構(gòu),破壞其完整性,使線粒體鈣瞬變幅度下降。⑵干擾Rictor組ESC-CMs中Cx43在線粒體中定位減少,且Cx43總蛋白含量下降,線粒體Cx43表達減少,而胞漿Cx43表達有所增加,這提示干擾Rictor導(dǎo)致ESC-CMs線粒體Cx43表達減少,可能是由于由胞漿轉(zhuǎn)運至線粒體的Cx4
14、3減少所致。免疫共沉淀實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Rictor組Cx43與Hsp90及TOM20相互作用顯著弱于陰性對照組。同時,Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp90脫乙?;{(diào)控蛋白HDAC6表達水平在干擾Rictor后顯著降低,Hsp90乙?;潭仍黾樱崾靖蓴_Rictor致ESC-CMs中Cx43轉(zhuǎn)運至線粒體減少可能與HDAC6表達減少,Hsp90乙?;潭仍黾?,Cx43與轉(zhuǎn)運蛋白Hsp90和TOM20結(jié)合減少有關(guān)。⑶過表達線粒體Cx4
15、3后EBs及ESC-CMs中ATP產(chǎn)量較干擾Rictor組顯著增加,且線粒體膜電位有所增加。提示過表達線粒體Cx43可逆轉(zhuǎn)干擾Rictor導(dǎo)致的ESC-CMs線粒體功能受損。同時流式細胞術(shù)檢測心肌細胞分化率結(jié)果顯示,過表達線粒體Cx43組心肌分化率較干擾Rictor組顯著增加,說明過表達線粒體Cx43提高線粒體功能可逆轉(zhuǎn)干擾Rictor對心肌分化的抑制作用。線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Rictor顯著下調(diào)ESC-CMs線粒
16、體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的酶活性,而過表達線粒體Cx43可提高酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的活性。干擾Rictor導(dǎo)致ESC-CMs中mPTP開放程度顯著增加,過表達線粒體Cx43可抑制mPTP開放。進一步研究發(fā)現(xiàn),干擾Rictor顯著下調(diào)ESC-CMs中p-AktSer473,p-GSK3βSer9表達水平,抑制線粒體p-GSK3βSer9與Cx43、p-Cx43Ser368,Cx43、p-Cx43Ser368與ANT、CypD相互結(jié)合,促進mP
17、TP開放。以上結(jié)果提示干擾Rictor一方面通過抑制Cx43轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜,減少線粒體Cx43表達,從而降低ESC-CMs線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的活性,另一方面,干擾Rictor通過抑制ESC-CMs中Akt-GSK3β通路,減弱Cx43與mPTP組成蛋白結(jié)合能力,促進mPTP開放,最終破壞心肌細胞線粒體呼吸鏈,損傷線粒體功能。
結(jié)論:①ES細胞體外定向分化心肌細胞中Rictor呈發(fā)育依賴性上調(diào),且定位于ESC-CMs內(nèi)
18、質(zhì)網(wǎng)和MAM結(jié)構(gòu)。干擾Rictor抑制小鼠ES細胞定向分化為心肌細胞。同時干擾Rictor破壞mTORC2完整性和抑制其活性,致ESC-CMs線粒體內(nèi)嵴腫脹甚至出現(xiàn)空泡,降低線粒體膜電位,破壞ESC-CMs中MAM結(jié)構(gòu),降低IP3R介導(dǎo)的線粒體鈣瞬變,減少ATP產(chǎn)量,損傷線粒體功能,但不引起線粒體依賴的細胞凋亡。②干擾Rictor致ESC-CMs線粒體功能損傷的作用機制一方面與其抑制Cx43轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜,減少線粒體Cx43表達,從而
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