基于BrdU的SuzukI-Miyaura偶聯(lián)在檢測細(xì)胞增殖中的應(yīng)用研究.pdf

1、細(xì)胞增殖是生物體重要的生命特征，也是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖檢測技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選、DNA復(fù)制的研究、干細(xì)胞研究、有機(jī)化合物和納米材料的毒性評價以及腫瘤放射敏感性評價等。檢測DNA復(fù)制的方法在單細(xì)胞水平直接檢測細(xì)胞增殖，是檢測細(xì)胞增殖最準(zhǔn)確的方法。BrdU/抗體免疫，EdU/點擊化學(xué)，VdU/Inverse Diels-Alder反應(yīng)是當(dāng)前最常見的三種檢測DNA復(fù)制的方法。這些檢測細(xì)胞增殖的方法都有各

2、自的優(yōu)缺點，其中的一些不足會限制它們的應(yīng)用。因此，發(fā)展一種新的方法可以彌補(bǔ)這些方法的不足之處，為細(xì)胞增殖檢測提供更多的選擇。Suzuki-Miyaura反應(yīng)是有機(jī)硼化合物與有機(jī)鹵或者有機(jī)擬鹵在鈀或者鎳的催化下發(fā)生的交叉偶聯(lián)反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成。近些年該反應(yīng)也被用于修飾及標(biāo)記多糖、蛋白質(zhì)、多肽及寡核苷酸和DNA等細(xì)胞組份。希望將Suzuki-Miyaura化學(xué)偶聯(lián)方法應(yīng)用于標(biāo)記增殖細(xì)胞DNA中所摻入的BrdU，從而實現(xiàn)細(xì)胞增殖的檢測。

3、
　　首先在70℃的條件下以BrdU和苯硼酸為底物在四種溶劑中驗證了該反應(yīng)的可行性。然后，在37℃使用不同的催化體系優(yōu)化反應(yīng)。結(jié)果表明使用n-Bu4N+OH-為堿時得到最佳實驗結(jié)果，可以進(jìn)一步應(yīng)用于增殖細(xì)胞標(biāo)記。在合成七種含硼酸基的染料的基礎(chǔ)上，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，DNA分子水平以及細(xì)胞水平的多次實驗摸索，以排除各種不利于細(xì)胞Suzuki-Miyaura偶聯(lián)標(biāo)記的因素。排除這些因素后，初步獲得了可以用于增殖細(xì)胞標(biāo)記的條件。
　　經(jīng)

4、重新優(yōu)化BrdU和苯硼酸的反應(yīng)并獲得最佳反應(yīng)條件后，使用三種染料硼酸和BrdU為模板的反應(yīng)表明染料硼酸可以和BrdU生成相應(yīng)的偶聯(lián)產(chǎn)物。在固定化細(xì)胞中，考察在四種條件下PdNP催化偶聯(lián)標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫氣保護(hù)條件下可得到滿意的結(jié)果。該方法下，DTBPPS支持的鈀納米顆粒和摻入細(xì)胞中的BrdU在氬氣保護(hù)下發(fā)生氧化加成，再在氫氣條件下與染料硼酸完成偶聯(lián)標(biāo)記。進(jìn)一步優(yōu)化染料濃度，鈀的用量以及標(biāo)記時間，從而得到最佳增殖細(xì)胞標(biāo)記條件。
　　使

5、用不同方法驗證了BrdU/Suzuki-Miyaura偶聯(lián)標(biāo)記方法的可靠性。結(jié)果顯示，1）HepG2，SH-SY5Y，MDA-MB-231，HeLa以及A172細(xì)胞中遞增BrdU濃度和偶聯(lián)標(biāo)記的熒光強(qiáng)度成正比;2）HepG2細(xì)胞中遞增BrdU孵育時間標(biāo)記的熒光強(qiáng)度成正比;3）用Aphidicolin阻滯細(xì)胞周期可阻斷標(biāo)記;4）BrdU-EdU共定位實驗表明BrdU/S uzuki-Miyaura偶聯(lián)標(biāo)記與EdU/點擊化學(xué)標(biāo)記兩種方法互相

6、兼容，且兩種方法都特異性的標(biāo)記增殖細(xì)胞。
　　將該方法應(yīng)用于腫瘤組織中檢測增殖細(xì)胞，結(jié)果表明經(jīng)過偶聯(lián)標(biāo)記后，可以很容易地區(qū)分增殖細(xì)胞和未增殖細(xì)胞。與EdU/點擊化學(xué)的方法聯(lián)合以用于追蹤DNA合成的Pulse-Chase實驗，結(jié)果表明增殖細(xì)胞被單色或兩色標(biāo)記，兩種標(biāo)記信號在時間和空間上具有可辨性。使用綠色熒光染料硼酸DEAC-硼酸及FITC-硼酸標(biāo)記增殖細(xì)胞，結(jié)果表明兩種硼酸染料均能特異性地標(biāo)記擴(kuò)增細(xì)胞，DEAC硼酸標(biāo)記結(jié)果理想而F