全反式視黃酸拮抗糖基化終末產(chǎn)物受體及下調(diào)氧化應(yīng)激抑制心肌缺血再灌注損傷機(jī)制研究.pdf

1、【目的】：
　　當(dāng)前我國(guó)急性ST段抬高型心肌梗死（ST-elevated Myocardial Infarction，STEMI）的發(fā)病率逐年增高，雖然心肌再灌注治療已成為廣泛開(kāi)展的治療措施，但臨床療效仍受多種因素干擾。在基礎(chǔ)研究方面，心肌缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion Injury，I/R injury）極大地影響了再灌注治療的療效，目前尚無(wú)滿(mǎn)意的預(yù)防和干預(yù)措施，因此也未形成規(guī)范治療方案。
　　本

2、研究的目的是通過(guò)基礎(chǔ)研究，探索可行的STEMI再灌注治療后I/R損傷的防治方法。通過(guò)嘗試應(yīng)用全反式視黃酸（All-Trans Retinoic Acid，ATRA）防治心肌梗死再灌注后 I/R損傷，闡明 ATRA在心肌 I/R中的作用機(jī)制及其對(duì)糖基化終末產(chǎn)物受體（Receptor for Advanced Glycation Endproducts，RAGE）效應(yīng)機(jī)制的關(guān)系。具體建立心肌細(xì)胞和活體動(dòng)物心肌梗死后 I/R損傷模型，檢測(cè) A

3、TRA是否能夠有效抑制心肌 I/R損傷，探索能夠有效消除RAGE介導(dǎo)的心肌I/R損傷及其他可能的機(jī)制，并總結(jié)和探索可行的I/R損傷防治策略，為有效預(yù)防和干預(yù)心肌I/R提供理論依據(jù)和干預(yù)方法。
　　【方法】：
　?。?）建立 H9C2心肌細(xì)胞缺氧再氧模擬的I/R損傷模型，比較不同濃度(10nM-100uM)的ATRA干預(yù)下，心肌細(xì)胞存活率，確定ATRA的有效濃度和毒性濃度；膜聯(lián)蛋白V凋亡檢測(cè)結(jié)合流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)不同濃度A

4、TRA的抗心肌細(xì)胞凋亡作用；用TUNEL染色方法檢測(cè)ATRA抗凋亡作用；用Western-blots方法檢測(cè)心肌梗死再灌注后凋亡相關(guān)信號(hào)天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specificproteinase-3，Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤蛋白-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p3

5、8MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）表達(dá)差異；
　?。?）在H9C2細(xì)胞缺氧再氧模擬的I/R損傷平臺(tái)上，用Western-blots方法檢測(cè)不同濃度ATRA干預(yù)下去整合素樣金屬蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase10，A

6、DAM10）和 RAGE表達(dá)差異；應(yīng)用ADAM10-短發(fā)夾核糖核酸（short hairpin ribonucleic acid，shRNA）干擾，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，用Western-blots方法檢測(cè)Capase-3、BCL-2、p38MAPK、JNK、ERK表達(dá)差異；用Carboxy-H2DCFDA試劑檢測(cè)不同濃度ATRA干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激程度；
　?。?）建立小鼠左前降支（left anterior descending ar

7、tery，LAD）結(jié)扎及再通模型模擬在體I/R損傷，用TTC染色方法檢測(cè)ATRA干預(yù)下野生型小鼠和RAGE基因敲除小鼠心肌梗死范圍差異；用超聲學(xué)方法檢測(cè)ATRA干預(yù)下小鼠I/R損傷后左室功能相關(guān)指標(biāo)；用TUNEL染色方法檢測(cè)ATRA干預(yù)下小鼠I/R損傷后心肌細(xì)胞凋亡的差異；用Western-blots方法檢測(cè)ATRA干預(yù)下小鼠I/R損傷后Capase-3、BCL-2、p38MAPK、JNK、ERK表達(dá)差異；用免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定AT

8、RA干預(yù)小鼠I/R損傷后，組織切片中的凋亡信號(hào)p38MAPK、JNK、ERK，以及ADAM10和RAGE表達(dá)差異。
　　【結(jié)果】：
　　（1） H9c2細(xì)胞經(jīng) I/R損傷后，相比二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）對(duì)照組，用1nM至10μM的ATRA預(yù)處理組存活細(xì)胞數(shù)量顯著升高（p<0.01），但100μM濃度ATRA預(yù)處理組則表現(xiàn)為存活細(xì)胞數(shù)量大幅度降低（p<0.01）；應(yīng)用ATRA濃度范圍10nM到

9、10μM預(yù)處理組各組的膜聯(lián)蛋白陽(yáng)性，即凋亡細(xì)胞比例顯著減少（p<0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性；TUNEL染色結(jié)果顯示ATRA終濃度為10nM到10μM預(yù)處理組中，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著下降（p<0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性；用Western blot方法檢測(cè)ATRA終濃度為1nM到10μM細(xì)胞凋亡的直接介導(dǎo)因子活化的caspase-3水平顯著下降，保護(hù)因子BCL-2水平顯著升高，凋亡信號(hào)p38MAPK、JNK、ER

10、K表達(dá)水平顯著下降（all p<0.01），上述效應(yīng)也表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性。
　　（2） H9c2細(xì)胞經(jīng)I/R損傷后，ATRA濃度在10nM-10μM范圍內(nèi)，ADAM10表達(dá)水平較DMSO對(duì)照組顯著升高，而RAGE表達(dá)水平則顯著降低（p<0.01），且分別表現(xiàn)出正相關(guān)性和負(fù)相關(guān)性；ADAM10-shRNA可有效沉默ADAM10表達(dá)（p<0.01），且RAGE表達(dá)顯著上調(diào)（p<0.01），同時(shí)應(yīng)用用ATRA1μM未能顯著恢復(fù)ADAM10

11、表達(dá)，也未能顯著降低由于ADAM10效應(yīng)沉默后引起的RAGE高表達(dá)（p>0.05）；ADAM10-shRNA沉默ADAM10表達(dá)后，Caspase-3表達(dá)顯著升高（p<0.01），而B(niǎo)CL-2表達(dá)顯著降低（p<0.01）；同時(shí)用ATRA1μM和ADAM10-shRNA時(shí)，Caspase-3表達(dá)較單純應(yīng)用ADAM10-shRNA顯著降低（p<0.01），BCL2表達(dá)顯著升高（p<0.01），但Caspase-3表達(dá)較單純應(yīng)用ATRA1μM

12、顯著升高（p<0.01），BCL2表達(dá)較單純應(yīng)用ATRA1μM顯著降低（p<0.01）；用ADAM10-shRNA沉默 ADAM10效應(yīng)后，凋亡信號(hào)p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活表達(dá)均顯著升高（all p<0.01）；同時(shí)用ATRA1μM和ADAM10-shRNA處理后，凋亡信號(hào)p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活水平分別較單純應(yīng)用ADAM10-shRNA顯著降低（p<0.01），但較單純應(yīng)用ATRA1μM顯著升高(p<0

13、.01)；經(jīng)ATRA濃度在10nM-10μM范圍內(nèi)預(yù)處理后，用Carboxy-H2DCFDA反應(yīng)液檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著降低（p<0.01），且表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性。
　?。?） TTC染色結(jié)果顯示在野生型小鼠中應(yīng)用ATRA預(yù)處理顯著降低了心肌I/R損傷后梗死面積（p<0.05），在糖基化終末產(chǎn)物基因敲除小鼠中，無(wú)論是否應(yīng)用ATRA預(yù)處理，心肌 I/R損傷后梗死面積與野生型對(duì)照組相比都顯著降低（p<0.05）；超聲學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)

14、ATRA預(yù)處理并進(jìn)行I/R損傷造模后，小鼠心輸出量、左室舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)較未進(jìn)行 I/R損傷造模組顯著降低（p<0.05），但心輸出量和射血分?jǐn)?shù)仍顯著高于未經(jīng)ATRA預(yù)處理組（p<0.05）；心肌組織切片TUNEL染色結(jié)果顯示應(yīng)用ATRA預(yù)處理較直接I/R損傷造模小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少（p<0.05）；應(yīng)用ATRA預(yù)處理后并后進(jìn)行 I/R損傷造模后，左室心肌組織細(xì)胞內(nèi)凋亡保護(hù)信號(hào)BCL-2表達(dá)水平顯著升高（p<0.05），而

15、凋亡直接信號(hào) Caspase-3表達(dá)水平顯著降低（p<0.05），凋亡信號(hào) p38MAPK、JNK、ERK的磷酸化激活水平顯著降低（p<0.05）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示應(yīng)用ATRA預(yù)處理后，梗死區(qū)域心肌凋亡信號(hào)p38MAPK、JNK、ERK磷酸化激活水平顯著降低（p<0.05）；而ADAM10表達(dá)水平顯著升高（p<0.05），RAGE表達(dá)水平顯著降低（p<0.05）。
　　【結(jié)論】：
　　本研究證實(shí)ATRA可有效防治ST