基底外側(cè)杏仁核motilin抗焦慮作用及其機制研究.pdf

1、【研究背景】
　　據(jù)統(tǒng)計2010年全球約有2.73億人患有焦慮癥(anxiety disorder),約占總?cè)丝诘?.5％,其中女性多于男性,分別為5.2%和2.8%。在歐洲、非洲和亞洲,終生患病率在9-16%,年患病率在4-7%之間,而在美國發(fā)病率明顯提高,終生患病率約為29%,11-18%的成年人在一生當(dāng)中曾經(jīng)遭遇這種狀態(tài)。
　　目前認為,焦慮癥的發(fā)生主要由以下幾個因素引起:藥物、心理因素、壓力、持續(xù)性的焦慮狀態(tài)、遺傳和

2、家庭因素、文化背景以及神經(jīng)回路信息傳遞異常。這些因素中的一個或多個相互作用從而導(dǎo)致不同類型焦慮癥的發(fā)生。
　　經(jīng)過多年的努力,人們對焦慮癥的發(fā)病機制雖然有了更深入的認識,但其分子生物學(xué)基礎(chǔ)仍不清楚。除了多種神經(jīng)遞質(zhì)參與其中以外,研究人員也發(fā)現(xiàn)了與焦慮行為相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),或許這一神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的信息傳遞異常才是焦慮癥發(fā)生的根本原因。鑒于此,有學(xué)者提出了焦慮癥的細胞模型,認為病理性焦慮癥是由于杏仁核起關(guān)鍵作用的神經(jīng)環(huán)路E/I平衡(bala

3、nce of excitation and inhibition)紊亂所導(dǎo)致的。因此,針對參與引起焦慮調(diào)節(jié)的分子,如神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)系統(tǒng)或者細胞內(nèi)信號蛋白等,通過改善E/I平衡,從而產(chǎn)生抗焦慮作用。
　　臨床上對焦慮癥的治療主要包括改變生活方式,心理治療和行為治療,而只有其他治療無效時才建議使用藥物治療。認知行為療法(cognitive behavioral therapy,CBT)是目前最有效的焦慮癥心理治療手段,它有兩個主要

4、組成成分:認知和行為。目前臨床上焦慮癥的治療藥物主要有以下幾種,選擇性5-HT再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs),五羥色胺-去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotonin–norepinephrine reuptake inhibitors,SNRIs),苯二氮類(benzodiazepines,BDZs),單胺氧化酶抑制劑和α-δ鈣通道抗驚厥藥等。由于這些藥物明顯的

5、副作用,如起效慢、順從性差、依賴性、以及可能的停藥反應(yīng),研究人員正努力尋找新的治療方法和分子靶點,其中最重要的一個方向就是神經(jīng)肽類(neuropeptides)。涉及焦慮調(diào)節(jié)功能的神經(jīng)肽類數(shù)目正不斷增加,到目前為止,研究最廣泛的有促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing factor,CRF)、P物質(zhì)(substance P,SP)、血管升壓素(vasopressin,VP)、神經(jīng)肽Y(neuropept

6、ide Y,NPY),其他類型如甘丙肽(galanin)、催產(chǎn)素(oxytocin)、胃動素(motilin),近年來也得到更多關(guān)注。
　　Motilin是一種主要由十二指腸粘膜內(nèi)分泌細胞釋放促進胃腸蠕動的腦腸肽,在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中均有分布,motilin受體(MTLR)是一個G蛋白偶聯(lián)受體,紅霉素(erythromycin,EM)是其最先發(fā)現(xiàn)的非肽類激動劑。研究發(fā)現(xiàn),

7、除胃腸道外,MTLR也表達于杏仁核、海馬和下丘腦等與焦慮和恐懼記憶相關(guān)的神經(jīng)核團。目前認為,杏仁核是神經(jīng)系統(tǒng)情緒控制,尤其是焦慮和恐懼相關(guān)刺激調(diào)節(jié)的核心區(qū)域。更為重要的是,有報道顯示腦室內(nèi)注射胃動素具有明顯的抗焦慮作用,但其機制仍不清楚。同時,杏仁核底內(nèi)側(cè)注射motilin劑量依賴地增加了清醒大鼠的胃收縮,而且,motilin受體大量表達在基底外側(cè)杏仁核區(qū)(basolateral amygdala,BLA),所有這些提示motilin及

8、其受體在杏仁核的表達不僅控制胃腸運動功能,可能在焦慮行為的調(diào)節(jié)中也具有重要作用。
　　【研究目的】
　　觀察杏仁核BLA區(qū)motilin受體激活對不同因素引起的小鼠焦慮樣行為的影響,考察杏仁核區(qū)motilin及其受體在不同神經(jīng)元上的表達差異,研究motilin對不同類型神經(jīng)元興奮性及神經(jīng)傳遞的作用,利用分子生物學(xué)、電生理學(xué)等手段揭示其可能的分子機制,為抗焦慮藥的研發(fā)提供新靶點,為焦慮癥的治療提供新的思路和理論依據(jù)。【研究方法

9、】
　　1.小鼠應(yīng)激模型建立共建立了3種小鼠焦慮模型。1)小鼠置于自制水瓶中強迫游泳1或2次,每次30 min,每天僅限一次,于不同時間點檢測小鼠焦慮樣行為,選擇最佳參數(shù)為強迫游泳應(yīng)激引起的小鼠焦慮模型;2)小鼠置于束縛器中1或2次,每次2 h,每天僅限一次,于不同時間點檢測小鼠焦慮樣行為,選擇最佳參數(shù)。
　　2.小鼠慢性炎性痛模型建立10μl完全弗氏佐劑(CFA)小鼠足底注射,于不同時間點檢測小鼠焦慮樣行為,選擇最佳參數(shù)。

10、
　　3.小鼠焦慮相關(guān)行為學(xué)檢測1)高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)檢測:小鼠頭朝開臂放于裝置中間平臺區(qū)后,實驗人員立即拉緊布簾,離開測試區(qū),開始為期5 min的檢測,軟件記錄開、閉臂滯留時間和進臂次數(shù)。2)曠場實驗:高架十字迷宮結(jié)束后立即進行曠場實驗。檢測時,小鼠被放于盒子中央?yún)^(qū),自由活動15 min,檢測小鼠在實驗箱總活動路程和中央?yún)^(qū)活動時間。我們定義實驗箱正中間的15×15 cm2區(qū)域為中央?yún)^(qū),占

11、整個面積的四分之一。每個箱子每次只允許檢測一只小鼠。
　　4.ELISA檢測強迫游泳應(yīng)激致焦慮小鼠和慢性炎性痛致焦慮小鼠杏仁核區(qū) motilin濃度的變化。
　　5.Western blot檢測焦慮小鼠MTLR表達的變化,以及藥物處理對其表達的影響。
　　6.杏仁核BLA區(qū)立體定位和微量注射1)腦立體定位手術(shù):套管定位于BLA區(qū)(bregma點后1.45 mm,旁開3.5 mm,下4.5 mm)上部0.5 mm后,立即

12、用牙科水泥固定,待凝固后套管中插入套管帽。小鼠恢復(fù)一周后,開始行為學(xué)檢測。2)局部微量注射:小鼠單獨放入小動物麻醉機麻醉后,插入注射內(nèi)管(比套管長0.5mm),用微量注射泵以0.5μl/min的速度通過套管注射不同藥物于雙側(cè)BLA區(qū),每側(cè)注射1min,后留針1min。注射完畢后,小鼠放回籠中,30min后接受強迫游泳應(yīng)激處理。在慢性炎性痛實驗中,注射完30min后,開始行為學(xué)檢測。
　　7.免疫熒光雙標(biāo)法考察MTLR在杏仁核的表達

13、,檢測是否有細胞特異性分布。
　　8.電生理學(xué)檢測 MTLR激活對興奮性和抑制性神經(jīng)元興奮性以及對興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞的影響。
　　【研究結(jié)果】
　　1.束縛應(yīng)激1次,24 h后小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,且兩次應(yīng)激24 h后更為明顯;強迫游泳應(yīng)激1次12 h后小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,24 h后有所緩解,兩次應(yīng)激24 h后則更為明顯;CFA注射14 d后小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,且至少持續(xù)到28 d后。
　　2.對 MTLR表達

14、檢測結(jié)果顯示,其表達水平隨束縛應(yīng)激次數(shù)的增加顯著下降,強迫游泳應(yīng)激兩次24 h后及CFA注射14 d后,其表達也明顯減少。ELISA檢測顯示,在相應(yīng)時間點杏仁核 motilin濃度也顯著降低。由于束縛應(yīng)激所用束縛器影響腦立體定位所留套管的穩(wěn)定性,容易造成套管脫落,所以下面實驗采用了強迫游泳應(yīng)激模型和慢性炎性痛模型。
　　3.杏仁核BLA區(qū)局部注射后行為學(xué)檢測結(jié)果顯示,motilin和EM注射顯著降低了強迫游泳應(yīng)激和慢性炎性痛小鼠E

15、PM中開臂滯留時間和曠場試驗中央?yún)^(qū)滯留時間,而對閉臂進入次數(shù)和活動總距離沒有影響,且MTLR選擇性拮抗劑MA-2029能夠逆轉(zhuǎn)EM的這一作用。
　　4.免疫熒光結(jié)果顯示,在杏仁核區(qū) MTLR與抑制性神經(jīng)元特異性標(biāo)記物谷氨酸脫羧酶67(glutamic acid decarboxylase67,GAD67)共定位,且MTLR免疫陽性神經(jīng)元在BLA區(qū)明顯多于側(cè)核(lateral amygdala,LA)。
　　5.對神經(jīng)元興奮性

16、檢測結(jié)果顯示,MTLR激活對BLA區(qū)錐體神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率以及靜息膜電位(rest membrane potential,RMP)沒有影響,但增加了中間神經(jīng)元動作電位發(fā)放頻率,且降低了其 RMP,而 MA-2029以及 G蛋白抑制劑GDP-β-S阻斷了MTLR激活對神經(jīng)元興奮性的影響。
　　6.對抑制性神經(jīng)傳遞的影響檢測結(jié)果顯示,強迫游泳應(yīng)激和慢性炎性痛均減弱了BLA區(qū)錐體神經(jīng)元GABA能自發(fā)的抑制性突觸后電流(spontan

17、eous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs)的幅度和頻率,EM和motilin增加了正常和焦慮小鼠sIPSCs的幅度和頻率,且這一作用被MA-2029所抑制。然而,MTLR激活對GABA能小的抑制性突出后電流沒有影響(miniature inhibitory postsynaptic currents,mIPSCs)。雙脈沖易化結(jié)果顯示,motilin顯著減弱了雙脈沖比率值(paired-p

18、ulse ratio,PPR),這一作用也能被MA-2029所阻斷。
　　7.對興奮性神經(jīng)傳遞的影響檢測結(jié)果顯示,MTLR激活對自發(fā)的興奮性突觸后電流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs)和小的興奮性突出后電流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)的幅度和頻率都沒有影響。
　　8.對小鼠痛覺影響

19、的檢測結(jié)果顯示,CFA注射14d后,與鹽水注射組相比,小鼠熱刺痛和機械痛痛閾明顯降低,但EM或motilin局部注射對熱刺痛和機械痛痛閾均沒有影響。
　　【研究結(jié)論】
　　本研究證實,MTLR選擇性表達在杏仁核區(qū)抑制性中間神經(jīng)元上;在束縛應(yīng)激、強迫游泳應(yīng)激以及慢性炎性痛導(dǎo)致的焦慮小鼠杏仁核區(qū) MTLR表達顯著下降,motilin濃度也明顯減少;而MTLR激動劑motilin和EM于杏仁核BLA區(qū)注射產(chǎn)生明顯的抗焦慮作用;機制