腎絡(luò)通對梗阻性腎病大鼠炎性介質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、由于先天性或獲得性泌尿系梗阻所致的梗阻性腎病是急性或慢性腎功能衰竭的常見原因之一，也是難治性反復(fù)發(fā)作的尿路感染的常見誘發(fā)因素。造成慢性泌尿系梗阻的機制非常復(fù)雜，其中包括血液動力學(xué)改變、炎性介質(zhì)、血管活性物質(zhì)、氧化應(yīng)激等因素的共同參與，最終導(dǎo)致腎臟損傷及腎功能衰竭。腎臟病的發(fā)生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone，RAAS)有密切關(guān)系，目前對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，An

2、gⅡ)的研究較多，其通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowth factor-β，TGF-β)途徑促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)的機制已經(jīng)比較明確，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensinconverting enzyme inhibitors，ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensinⅡ receptor blockers，ARB)后可減輕慢

3、性腎臟病患者腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷，但仍有不少患者，即便足量的ACEI及ARB治療亦未能有效，說明有其他因素如炎性損傷、氧化應(yīng)激的參與。已有的研究表明，炎性損傷在慢性疾病持續(xù)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，故抗炎治療對于慢性疾病的預(yù)后有重要意義。這種炎性損傷并非單純由外界感染所致，而是以內(nèi)源性炎性損傷為主，且與RIF的持續(xù)進(jìn)展密切相關(guān)，炎性介質(zhì)在其中的作用也得以重視。有研究指出炎性介質(zhì)例如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotactic

4、protein1，MCP-1)、白介素-1β(Interleukin1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducednitric oxide synthase，iNOS)是各種慢性腎臟疾病中引起腎臟炎癥和纖維化的重要因素。隨著對RAAS的深入研究，發(fā)現(xiàn)除了AngⅡ外，醛固酮也可通過激活其下游效應(yīng)介質(zhì)血清糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(Serum andglucoc

5、orticoid-induced protein kinase1，SGK-1)及核轉(zhuǎn)錄因子κ B(NuclearfactorκB，NF-κB)、氧化應(yīng)激等多種途徑導(dǎo)致腎臟炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積聚，最終導(dǎo)致RIF的進(jìn)展，故阻斷醛固酮活化造成的炎性損傷對于減緩腎臟病的進(jìn)展有重要意義。本次實驗通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)建立

6、梗阻性腎病間質(zhì)纖維化實驗動物模型，觀察鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑依普利酮和化瘀滌痰通絡(luò)方腎絡(luò)通煎劑對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠炎性介質(zhì)表達(dá)的影響，利用實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time polymerase Chain Reaction，Real-timePCR)、免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)、放射免疫分析法等技術(shù)檢測血

7、清醛固胴、血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid-inducedprotein kinase1，SGK-1)及MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β、核轉(zhuǎn)錄因子κ B(Nuclear factorκ B，NF-κ B)和α平滑肌激動蛋白(α-smooth muscleprotein，α-SMA)等指標(biāo)的變化，從組織、分子、基因水平研究腎絡(luò)通煎劑的作用機制，為中藥治療梗阻性腎病提供理論和實驗

8、依據(jù)。
　　第一部分“毒”、“瘀”傷腎機制及關(guān)聯(lián)
　　簡述了“毒”和“瘀”的概念、分類、形成機制、兩者在腎病中的發(fā)病機制，以及毒邪和瘀血的相互影響、毒瘀互結(jié)在腎病中的作用、毒瘀相關(guān)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及臨床意義等內(nèi)容。
　　大量實驗研究表明，腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病的病理表現(xiàn)和共同通路，而炎性損傷在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中是一種啟動和誘發(fā)因素?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，炎性細(xì)胞的浸潤、炎性介質(zhì)的釋放、促纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)等均可

9、歸屬于中醫(yī)“內(nèi)毒致病”范疇，而細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟的積聚是“瘀”的表現(xiàn)，由此可見，以炎性損傷為特征的“毒”為起因，纖維化為表現(xiàn)的“瘀”為結(jié)果，二者交互錯雜，導(dǎo)致和加重腎間質(zhì)纖維化，且貫穿于腎臟病的整個病理過程。同時，也總結(jié)出“毒”和“瘀”可作為慢性腎臟病的基本病機。
　　在臨床上，腎臟病的進(jìn)展與感染有密切關(guān)系，或因感染而誘發(fā)，或因感染而加重，且腎病患者易于感染，這種感染所致的炎性損傷在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，抗炎治療可能

10、是治療靶點?！岸尽薄ⅰ梆觥辈C學(xué)說的提出為臨床治療慢性腎臟疾病提供了理論依據(jù)，對于慢性腎病的進(jìn)展可能有重要意義。
　　第二部分腎絡(luò)通對梗阻性腎病大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響
　　方法:48只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham group)、UUO組(UUOgroup)、依普利酮組(EPL group)、腎絡(luò)通組(SLT group)，每組12只。實驗動物自由進(jìn)食和飲水，溫度條件控制在(22±2)℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1WK后

11、，除假手術(shù)組(Sham group)，其余大鼠按照Iwai T的方法制備單側(cè)輸尿管梗阻模型。大鼠給以10％水合氯醛注射后，于左側(cè)中腹部切開皮膚，游離左側(cè)輸尿管，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用絲線結(jié)扎，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。術(shù)后第3天腎臟組織病理顯示炎性細(xì)胞浸潤，第5日后腎間質(zhì)膠原纖維沉積，術(shù)后第10天梗阻側(cè)腎臟明顯大于對側(cè)，腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤以及膠原纖維沉積，腎小管上皮細(xì)胞變性、濁腫、脫

12、落甚至壞死，腎小管部分萎縮，管腔閉塞或擴張，與文獻(xiàn)報道相似，符合腎間質(zhì)纖維化病理改變，模型復(fù)制成功。本次實驗成功率為92％，UUO術(shù)后大鼠死亡5只，用備用大鼠補足。術(shù)后開始給藥，依普利酮組給以依普利酮100 mg/(kg.d)從飼料中加入，腎絡(luò)通組給以腎絡(luò)通煎劑26 g/(kg.d)入水瓶飲用，假手術(shù)組及UUO組給予等容量生理鹽水飲用。均每天1次。連續(xù)干預(yù)10天。觀察一般情況。于實驗結(jié)束時，稱重，斷頭取血，分離血清，用于指標(biāo)檢測;取左側(cè)

13、（梗阻側(cè)）腎臟稱重，計算各組腎重/體重比值，進(jìn)行腎臟組織HE、MASSON染色，觀察組織病理學(xué)改變。
　　數(shù)據(jù)資料結(jié)果使用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件分析處理。各組數(shù)據(jù)比較前先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，滿足正態(tài)性及方差齊性者，采用方差分析，多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD檢驗。數(shù)值變量以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。顯著性差異水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。
　

14、　結(jié)果:
　　1、各組大鼠一般情況比較
　　實驗中大鼠死亡5只，用備用大鼠補足。整個實驗過程中假手術(shù)組大鼠一般情況良好:每日飲食、飲水量穩(wěn)定，體重逐步增長，毛發(fā)有光澤，活動敏捷，對外界刺激反應(yīng)靈敏。UUO術(shù)后1天，造模動物的進(jìn)食量、飲水量、體重均有所下降。術(shù)后6天，UUO組大鼠整體狀態(tài)欠佳:活動較前明顯減少，毛發(fā)松散無光澤。與假手?jǐn)?shù)組相比，造模動物體重不增反而下降。UUO手術(shù)10天后，造模大鼠體重增長緩慢，且與假手術(shù)組有顯著

15、性差異(P＜0.01，P＜0.05);與UUO組相比，依普利酮組及腎絡(luò)通組大鼠梗阻側(cè)腎重，腎重/體重指數(shù)明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)。UUO手術(shù)后，造模大鼠進(jìn)食量、飲水量、24h尿量均有所下降，但各組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　2、各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變
　　HE染色顯示，假手術(shù)組腎臟結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，無濁腫，間質(zhì)無水腫，偶見炎性細(xì)胞浸潤;UUO組腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管明

16、顯擴張，上皮細(xì)胞變性、濁腫、脫落甚至壞死;依普利酮組及腎絡(luò)通組小管擴張及上皮細(xì)胞水腫壞死與UUO組基本相同，但炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。Masson染色顯示，假手術(shù)組有少量膠原纖維表達(dá)，可見于腎小球/腎小管基底膜及腎間質(zhì);UUO組結(jié)構(gòu)紊亂，膠原成分顯著增多，以腎間質(zhì)為主;依普利酮組及腎絡(luò)通組膠原纖維表達(dá)較假手術(shù)組增多，但與UUO組相比明顯減少。
　　3、各組大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞計數(shù)比較
　　與假手術(shù)組比較，UUO組大鼠炎性細(xì)胞浸潤

17、明顯增多(P＜0.01)。與UUO組相比，依普利酮組、腎絡(luò)通組大鼠炎性細(xì)胞浸潤減少有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。與髓質(zhì)區(qū)相比，皮質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤明顯增多有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05);與皮質(zhì)區(qū)比較，皮髓交界區(qū)質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤減少，有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)。
　　第三部分腎絡(luò)通對梗阻性腎病大鼠MCP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS等炎性介質(zhì)表達(dá)的影響
　　方法:動物分組、模型復(fù)

18、制、給藥方法同第二部分，共10天。實驗結(jié)束時留取血清和腎臟標(biāo)本，采用ELISA測定血清MCP-1含量，放射免疫法測定血清TNF-α、iNOS、IL-1β含量，Real time-PCR、免疫組化、Western blot檢測MCP-1、TNF-α mRNA及蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)方法同第二部分。
　　結(jié)果:
　　1、各組大鼠血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β表達(dá)比較
　　與假手術(shù)組比較，UUO組中血清MCP-

19、1、TNF-α、iNOS、IL-1β含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。與UUO組比較，依普利酮組及腎絡(luò)通組血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β含量均減少，其中以依普利酮組更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。
　　2、Real-time PCR檢測MCP-1mRNA、TNF-αmRNA的表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組中MCP-1 mRNA及TNF-α mRNA表

20、達(dá)明顯增強(P＜0.01）。與UUO組比較，依普利酮組及腎絡(luò)通組MCP-1 mRNA及TNF-α mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，其中以依普利酮組更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3、免疫組化檢測MCP-1、TNF-α表達(dá)
　　假手術(shù)組MCP-1、TNF-α呈弱表達(dá)，UUO組中MCP、TNF-α表達(dá)明顯增強，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿。與UUO組比較，依普利酮及腎絡(luò)通組其表達(dá)范圍及強度均顯著減弱。
　　4、W

21、estern Blot檢測MCP-1及TNF-α蛋白表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組MCP-1、TNF-α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。與UUO組比較，依普利酮組及腎絡(luò)通組其表達(dá)均被下調(diào)，其中以依普利酮組下調(diào)更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　第四部分腎絡(luò)通對梗阻性腎病大鼠血清醛固酮及SGK-1表達(dá)的影響
　　方法:動物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第二部分，共10天。實驗結(jié)束時留取血清和腎臟標(biāo)本，采用放射免疫分析法檢

22、測血清醛固酮含量，Real-time PCR、Western blot測定腎組織SGK-1mRNA及蛋白表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)方法同第二部分。
　　結(jié)果:
　　1、放射免疫法檢測各組大鼠血清醛固酮含量
　　與假手術(shù)組比較，UUO組中血清醛固酮含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與UUO組比較，依普利酮組血清醛固酮含量有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05），腎絡(luò)通組血清醛固酮含量明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01

23、)。
　　2、Real-time PCR檢測SGK-1 mRNA的表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組中SGK-1 mRNA表達(dá)明顯增強。與UUO組比較，依普利酮及腎絡(luò)通組SGK-1 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　3、Western Blot檢測SGK-1蛋白表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組SGK-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。與UUO組比較，依普利酮組及腎絡(luò)通組其表達(dá)均被下調(diào)，其中以依普利酮組下降更為顯著。
　　第

24、五部分腎絡(luò)通對梗阻性腎病大鼠及α-SMA及NF-κ B表達(dá)的影響
　　方法:動物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第二部分，共10天。實驗結(jié)束時留取腎臟標(biāo)本，采用免疫組化、Western Blot檢測α-SMA及NF-κB蛋白表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)方法同第二部分。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組化檢測各組大鼠NF-κB、α-SMA表達(dá)
　　假手術(shù)組NF-κ B呈弱表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞;UUO組NF-κ B表達(dá)明顯增強，近曲小

25、管尤為明顯;依普利酮組及腎絡(luò)通組NF-κ B表達(dá)范圍及強度較UUO組均明顯減弱。
　　假手術(shù)組α-SMA僅表達(dá)于血管，腎間質(zhì)及上皮細(xì)胞未見表達(dá);UUO組α-SMA表達(dá)明顯增強，以擴張的腎小管表達(dá)為甚，間質(zhì)亦可見到陽性表達(dá);依普利酮組及腎絡(luò)通組α-SMA局部呈中度表達(dá)，間質(zhì)可見少量表達(dá)。
　　2、Western Blot檢測各組大鼠α-SMA、NF-κB表達(dá)
　　與假手術(shù)組比較，UUO組α-SMA、NF-κB蛋白表達(dá)明顯

26、上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與UUO組比較，依普利酮組及腎絡(luò)通組其表達(dá)均被下調(diào)，其中以依普利酮組下調(diào)更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、“毒”和“瘀”是慢性腎病的基本病機，以炎性損傷為特征的“毒”為起因，以纖維化為表現(xiàn)的“瘀”為結(jié)果，二者相互關(guān)聯(lián)、相互促進(jìn)，導(dǎo)致和加重腎間質(zhì)纖維化，且貫穿于腎臟病的整個病理過程。
　　2、結(jié)扎單側(cè)輸尿管復(fù)制腎間質(zhì)纖維化實驗動物模型，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞

27、浸潤及膠原成分顯著增多。腎絡(luò)通及依普利酮能顯著減輕UUO誘導(dǎo)的腎實質(zhì)損傷，減少炎性細(xì)胞浸潤，延緩間質(zhì)纖維化進(jìn)展。
　　3、炎性損傷是梗阻性腎病的重要起始因素，炎性介質(zhì)在其中發(fā)揮重要作用。其中，MCP-1、TNF-α、IL-1β及iNOS等炎性介質(zhì)是慢性腎臟疾病中介導(dǎo)的腎臟炎癥和間質(zhì)纖維化的重要因子。腎絡(luò)通和依普利酮能下調(diào)其表達(dá)，從而抑制梗阻性腎病中炎性損傷和炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而延緩間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。
　　4、醛固酮可通過激活其