白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠腎損傷的保護(hù)作用.pdf

1、梗阻性黃疸(obstructivej aundice，OJ)導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損傷，從而產(chǎn)生一系列并發(fā)癥，如敗血癥和腎功能衰竭等。OJ引起腎功能損害的原因未明，可能是由于嚴(yán)重肝功能障礙導(dǎo)致腎臟的血流動力學(xué)改變所致，其腎臟血流動力學(xué)改變的特征是：腎內(nèi)血管收縮，腎臟血流重新分布，血流自腎皮質(zhì)向髓質(zhì)分流，腎皮質(zhì)缺血，腎小球入球小動脈收縮，腎小球?yàn)V過率下降。另外，OJ時可產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素血癥(endotoxemia，ETM)，膽道梗阻時由于細(xì)胞

2、外液及細(xì)胞內(nèi)液的減少以及存在的內(nèi)毒素血癥從而引起氧自由基增多，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧蓄積并對機(jī)體產(chǎn)生損傷作用，機(jī)體抗氧化機(jī)制不足以清除過多的氧自由基，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷而加重腎功能損害。
　　 血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解起始代謝的限速酶。HO在降解血紅素的過程中減少活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生。在這個過程中它可以產(chǎn)生相同量的一氧化碳和膽綠素，同時釋放出鐵離子。臨床研究表明血紅素的增加可以導(dǎo)致急性腎小管壞死，而HO

3、系統(tǒng)可以減少腎組織損害。HO有三種亞型，HO-1、HO-2、HO-3，其中HO-1為可誘導(dǎo)型。HO-1在氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)下產(chǎn)生并對抗氧化應(yīng)激的損傷。血紅素的代謝產(chǎn)物一氧化碳、膽綠素和鐵離子均具有抗氧化和抗細(xì)胞凋亡的作用。
　　 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種在桑椹、葡萄和紅酒中發(fā)現(xiàn)并提取出來的多聚苯復(fù)合物，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)表現(xiàn)出廣泛的生物作用包括抗氧化、抗癌及抗炎癥作用。
　

4、　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過研究OJ大鼠腎臟HO-1、ZO-1、occludin表達(dá)水平及其在損傷中的作用，探討白藜蘆醇對BDL大鼠腎臟HO-1水平的影響及其在氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　 方法：采用健康雄性wistar大鼠，BDL方法制備動物模型，共60只。白藜蘆醇用1％羧甲基纖維素鈉制成白藜蘆醇混懸液。隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(sham operation，SO)，膽總管結(jié)扎組(BDL)，膽總管結(jié)扎+溶劑組(BDL+Veh

5、icle)，膽總管結(jié)扎+不同濃度白藜蘆醇組(10mg/kg，20 mg/kg）(BDL+Res10mg/kg，20mg/kg)。分別于術(shù)后1wk、2wk留取標(biāo)本。采用HE染色觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察腎臟的超微結(jié)構(gòu)；鱟試劑終點(diǎn)顯色法檢測血漿內(nèi)毒素(endotoxin，ET)含量；硫代巴比妥酸法檢測腎組織勻漿中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase

6、，SOD)的活力；原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)即TUNEL染色檢測腎臟細(xì)胞凋亡情況；免疫組織化學(xué)(SP)法檢測HO-1及緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)與定位；Real time PCR和western blot方法檢測HO-1在腎臟的表達(dá)水平。
　　 (1)肝功能結(jié)果證明BDL大鼠模型制作成功。
　　 (2)光鏡下腎組織病理學(xué)顯示：BDL組和BDL+Vehicle組大鼠于膽管結(jié)扎術(shù)后1wk腎近曲小管上皮細(xì)胞開始出現(xiàn)

7、輕度腫脹，術(shù)后2wk腎近曲小管上皮細(xì)胞水腫較1wk時加重。Res治療后腎近曲小管上皮細(xì)胞較單純BDL組水腫輕。
　　 (3)透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)：BDL組和BDL+Vehicle組大鼠于膽管結(jié)扎術(shù)后1wk時腎小球?yàn)V過屏障表現(xiàn)為基底膜輕度增生，足突及內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生融合，近曲小管線粒體大部分嵴和膜融合，可見空泡。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度顆粒融合和脫顆?，F(xiàn)象；術(shù)后2wk腎小球?yàn)V過膜病變加重，足細(xì)胞和基底膜重度增生，融合成一片，血管內(nèi)皮細(xì)

8、胞重度增生，近曲小管細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量髓樣化致密化的線粒體。Res組線粒體正常，但粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)仍可見融合和脫顆?，F(xiàn)象。
　　 (4)大鼠血漿內(nèi)毒素(endotoxin，ET)：BDL組ET水平在各時段明顯高于SO組（P＜0.01），Res10mg/kg，Res20mg/kg組大鼠術(shù)后2wkET水平低于同時段BDL組(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 (5)內(nèi)生肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)

9、和尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretory，Uaer)：與SO組比較，BDL組血清Ccr水平在術(shù)后2wk時明顯下降（P＜0.01），Uaer水平于術(shù)后1wk時明顯升高(P＜0.01)，2wk時更顯著(P＜0.001)。BDL+Res2wk治療組Ccr水平較同時相BDL組與BDL+Vehicle組升高（P＜0.05），Uaer水平下降（P＜0.01），但各治療組無明顯差別（P＞0.05）。
　　 (6)腎

10、組織MDA、SOD含量的變化：BDL組腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平在各時段明顯高于SO組(P＜0.01)，SOD活力明顯低于SO組（P＜0.01）；Res組大鼠術(shù)后2wkMDA水平低于同時段BDL組(P＜0.05)，SOD活力明顯高于同時段BDL組(P＜0.01)，但各治療組無明顯差別(P＞0.05)。
　　 (7)腎組織ZO-1、occludin免疫組織化學(xué)檢測：BDL大鼠術(shù)后2wk腎臟ZO-1陽性細(xì)胞數(shù)減少，光密度(OD)

11、值BDL組（0.10±0.02）明顯低于SO組(0.17±0.00)(P＜0.01)，BDL+Res組（0.12±0.01，0.12±0.01）較同時段BDL組增加（P＜0.05），但各治療之間無明顯差別（P＞0.05）；BDL大鼠術(shù)后2wk腎臟occludin陽性細(xì)胞數(shù)減少，OD值BDL組(0.09±0.02)明顯低于SO組(0.14±0.01)（P＜0.01），BDL+res組（0.12±0.01，0.13±0.01）較同時段BDL

12、組增加（P＜0.01），但各治療組之間無明顯差別(P＞0.05)。
　　 (8)腎組織HO-1免疫組織化學(xué)檢測：BDL大鼠在術(shù)后2wk大鼠腎臟HO-1陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞漿內(nèi)黃染顆粒增加，OD值BDL組（0.14±0.01）明顯高于SO組（0.05±0.01）（P＜0.01），BDL+res組（0.24±0.03，0.17±0.01）與BDL組比較明顯升高(P＜0.01)，10mg組好于20mg組。
　　 (9)Wester

13、nblot印跡半定量檢測腎組織HO-1表達(dá)：Western印跡分析顯示約相對分子質(zhì)量32kDa處可見雜交蛋白條帶，2wk組BDL組A值百分比(HO-1/GAPDH)（0.63±0.06）高于SO組（0.25±0.07）（P＜0.01），BDL+Res10mg/kg治療組（0.81±0.05）高于同時段BDL組（P＜0.01），10mg組好于20mg組。
　　 (10)Real time PCR分析結(jié)果顯示：BDL組大鼠腎組織HO

14、-1mRNA表達(dá)（3.76±0.77）高于SO組（1.00±0.00）（P＜0.05），BDL+res10mg/kg組（6.13±1.29）與同時段BDL組比較升高（P＜0.05），10mg組好于20mg組。
　　 結(jié)論：
　　 (1)梗阻性黃疸大鼠存在內(nèi)毒素血癥、腎臟氧化應(yīng)激損傷和腎臟細(xì)胞凋亡。
　　 (2)梗阻性黃疸大鼠腎臟上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)減少。
　　 (3)梗阻性黃疸大鼠腎臟HO-1蛋白及