乙酰化白藜蘆醇對(duì)大鼠海水吸入型肺損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景:
　　淹溺是一個(gè)重大但時(shí)常被忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),每年約有50萬(wàn)人死于淹溺。肺臟是吸入海水后首先受到侵害的重要臟器,研究表明吸入海水所致肺損傷明顯比吸入淡水嚴(yán)重。海水吸入型肺損傷(SeawaterInhalationInducedAcuteLungInjury,SWI-ALI)主要表現(xiàn)為肺部炎癥反應(yīng)和肺水腫,具體發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,可以肯定的是損傷的嚴(yán)重程度取決于液體的吸入量和清潔程度。海水吸入型肺損傷病情發(fā)展

2、迅速,如未及時(shí)治療或處置不當(dāng)易發(fā)展為海水吸入型呼吸窘迫綜合征(SeawaterInhalationInducedAcuteRespiratoryDistressSyndrome,SWI-ARDS)。近年來(lái),對(duì)海水吸入型肺損傷發(fā)病機(jī)制和救治的研究日益增多,但是對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未形成統(tǒng)一認(rèn)識(shí),未能提出切實(shí)有效、有針對(duì)性的治療措施。
　　核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是一種幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和癌

3、變等多種病理生理過(guò)程。通常細(xì)胞中NF-κB與IκB結(jié)合存在于細(xì)胞漿中;當(dāng)受到LPS、TNF-α和IL-1等刺激時(shí),IκB被迅速降解,游離狀態(tài)的NF-κB轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核,與相應(yīng)目的基因結(jié)合并促使其轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。NF-κB調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子的表達(dá),介導(dǎo)組織損傷與修復(fù);其中缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)是其重要的下游調(diào)節(jié)因子,三者共同參與多種疾病的發(fā)生于發(fā)展。在此理論基礎(chǔ)上,NF-κB相關(guān)信號(hào)通路在

4、海水吸入型肺損傷中的作用成為本課題的研究重點(diǎn)。
　　白藜蘆醇(Resveratrol)是廣泛存在于多種植物體內(nèi)的多酚化合物,是一種植物抗毒素,具有多種生物活性,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞老化等;因此,近年來(lái)對(duì)白藜蘆醇的研究較為多見(jiàn)。然而,由于白藜蘆醇生物半衰期短和血藥濃度低等原因,其臨床應(yīng)用始終面臨種種困難。乙?；邹继J醇是白藜蘆醇三個(gè)羥基被乙?；〈蟮漠a(chǎn)物,在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇發(fā)揮藥理活性,并且能夠增加白藜蘆醇在肺

5、部蓄積濃度同時(shí)延長(zhǎng)生物半衰期,前期研究表明乙?；邹继J醇能夠通過(guò)抑制活性氧類(lèi)(reactiveoxygenspecies,ROS)的生成降低γ-射線照射時(shí)小鼠的死亡率。在本研究中,我們通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)觀察大鼠吸入海水后肺部損傷性變化及乙?；邹继J醇的保護(hù)作用;在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,我們采用白藜蘆醇,乙酰化白藜蘆醇的代謝產(chǎn)物,研究其保護(hù)作用的具體機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　(1)明確乙酰化白藜蘆醇能否抑制炎癥反應(yīng)和氧化損傷減輕海水吸入型肺

6、損傷;
　　(2)進(jìn)一步探討乙?；邹继J醇抗炎、抗氧化的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,尤其是NF-κB、iNOS和HIF-1α等信號(hào)分子在其中的作用;
　　(3)細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路在海水吸入型肺損傷中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　健康雄性SD大鼠按照完全隨機(jī)的方法分為6組:A組:空白對(duì)照組;B組:海水吸入型肺損傷模型組;C組:乙酰化白藜蘆醇低劑量(50mg/kg)組;D組:中劑量組(150mg/kg

7、);E組:高劑量組(450mg/kg)預(yù)處理組;和F組:PDTC預(yù)處理組(100mg/kg)。各預(yù)處理組從造模前7天開(kāi)始每天灌胃相應(yīng)藥物,最后一次灌胃90分鐘后造模,向?qū)嶒?yàn)大鼠氣管內(nèi)滴注配方海水4ml/kg。造模4小時(shí)后放血處死取肺組織標(biāo)本。采用HE染色的方法觀察各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷變化;通過(guò)ELISA的方法檢測(cè)肺組織中TNF-α和IL-1β的含量,分別采用硫代巴比妥酸(ThibabituricAcidTBA)法和黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肺

8、組織中MDA含量和T-SOD活性,用WesternBlot的方法檢測(cè)NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達(dá)量。以評(píng)價(jià)乙?；邹继J醇對(duì)海水吸入后所致炎癥和氧化損傷的改善作用。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為4組,A:正常培養(yǎng)組;B:海水刺激組;C:白藜蘆醇干預(yù)組;D:PDTC預(yù)處理組。C組和D組在分別加入200μmol/L白藜蘆醇和PDTC30分鐘后進(jìn)行海水刺激。同時(shí)向B、C和D組加入含有25％配方海水

9、的培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)4小時(shí)后棄去培養(yǎng)基進(jìn)行免疫熒光染色操作,檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達(dá)量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　與空白對(duì)照組相比,大鼠吸入海水后肺組織結(jié)構(gòu)受到破壞,肺泡壁增厚并伴有局部塌陷;肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量水腫液滲出和炎細(xì)胞浸潤(rùn);肺組織內(nèi)代表?yè)p傷效應(yīng)的TNF-α、IL-1β、MDA和NO等表達(dá)量增加(P<0.05),而代表抗損傷效應(yīng)的T-SOD活性降低(P<0.05);同時(shí),

10、海水吸入能夠?qū)е翹F-κB、HIF-1α和iNOS的表達(dá)量增高(P<0.05)。然而,乙酰化白藜蘆醇預(yù)處理組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、MDA和NO表達(dá)量相對(duì)降低(P<0.05),T-SOD表達(dá)量增高(P<0.05),且高劑量組效果最為明顯(P<0.01);同時(shí),乙?；邹继J醇降低肺組織中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達(dá)量(P<0.05),且干預(yù)效果與PDTC無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　與

11、正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比,海水刺激后A549細(xì)胞中NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達(dá)量明顯增高,而乙?；邹继J醇體內(nèi)代謝產(chǎn)物白藜蘆醇預(yù)處理后NF-κB、HIF-1α和iNOS的表達(dá)量顯著降低,與PDTC效果無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　NF-κB及其下游的信號(hào)分子HIF-1α和iNOS構(gòu)成的信號(hào)通路參與海水吸入型肺損傷的發(fā)生與發(fā)展;乙?；邹继J醇能夠通過(guò)干預(yù)此信號(hào)通路的表達(dá),抑制下游炎癥因子等的表達(dá)減輕海水吸入所致的肺部炎癥